دانلود پایان نامه

آب به ١٠٠ میلی لیتر محیط کشت Mineral salt medium اضافه شد و در دمای ٣٠ درجه سانتی گراد و به مدت یک هفته و rpm١۷٠ در انکوباتور شیکردار انکوبه شد.

مرحله دوم جداسازی:
١میلی لیتراز فلاسک اول به ١٠٠میلی لیترازمحیط جدیداضافه شد.دمای ٣٠ درجه سانتیگراد وبرای مدت ١هفته وrpm ١۷٠ در انکوباتور شیکردار انکوبه شد .

مرحله سوم جداسازی:
نمونه فلاسک دوم در محیط کشتmedium salt mineral agar Solid کشت داده شده و در دمای ٣٠ درجه سانتی گراد و به مدت ٤- ٣ روز انکوبه شد.بعد از این مدت باکتری ها در محیط رشد کردند و این باکتری ها را در محیط broth Nutrient & agar Nutrient کشت داده شد(۴۴).
٣-٣-شناسایی باکتری:
بعد از جداسازی باکتری ، از طریق رنگ آمیزی گرم و روش میکروسکوپی باکتری بررسی شد. برای تشخیص گونه باکتری در محیط های کشت افتراقی کشت داده شد.تست IMViC انجام شد و باکتری در محیط های سیمون سیترات ، مک کانکی ، MRVP ، TSI کشت داده شد.

٣-۴-سنجش میزان تجزیه فنل توسط باکتری جداسازی شده:
ml ۱ از محلول رویی محیط کشت که باکتری در آن رشد کرده بود برداشته و Hp آن با 4OS2(4NH) به ۱۰رسید و lμ۱۰۰ از 6(CN)Fe3K اضافه شد و بعد از این lμ۱۰۰ از Pyrine Anti Amino_ 4 اضافه شد و ۱۵ دقیقه در دمای اتاق گذاشته تا به رنگ قرمز در آید و سپس جذب نوری آن در طول موج ۵۰۰ نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر بررسی شد (۴۵).
x=( فنل اولیه غلظت-باقیمانده فنل غلظت )/(فنل اولیه غلظت)×١٠٠

٣-۵- Cell concentration:
قبلا یک کاغذ صافی واتمن شماره ١ را برداشته ودر دمای ٨٠ درجه سانتی گراد برای ٢٤ ساعت گذاشته شد ( در داخل فویل آلومینیوم ) و سپس بعد از خشک شدن آن را وزن کردیم. برای اندازه گیری نمونه ها، ارلن ها را تک تک از کاغذ صافی واتمن شماره ١ عبور دادیم و در دمای ٨٠ درجه برای ٢٤ ساعت خشک شد و سپس وزن کاغذ صافی حاوی سلول باکتری را از وزن کاغذ صافی خشک کم کردیم تا وزن خالص بدست آید(۴۶).

_در هر دو آزمایش طراحی شده Burman-Plackett, methodology surface Respons) RSM(، اندازه گیری غلظت فنل و Cell concentration برای همه ی لوله ها انجام گرفت.

٣-۶-روش بهینه سازی و طراحی آزمایش
این طراحی در ٢ مرحله و با دو روش متفاوت با استفاده از نرم افزار۱۶Minitab انجام شد: الف-طراحی آزمایش ( نرم افزار Burman-Plackett)
ب- طراحی آزمایش (RSM) methodology facesur Response ٣-۶-۱-طراحی آزمایش ( نرم افزار Burman-Plackett):
بعد از جداسازی باکتری به منظور انتخاب بهترین منبع کربن بر اساس طراحی Burman-Plackett ، ۱۲ آزمایش طراحی شد (جدول ۳-۴).بدین منظور سوبستراهایی با ٣ منبع کربن و ٢ منبع ازت با بیشترین و کمترین مقادیر تهیه گردیدند.
منابع کربن شامل آمونیوم سولفات ، منیزیم سولفات و سدیم کلرید است و منبع ازت شامل پپتون، مخمر است . بدین ترتیب بر اساس جدول های شماره ٣-۴و٣-۵ طراحی انجام و غلظت ها انتخاب شد. بدین ترتیب تاثیر متغیرها بر میزان رشد باکتری ها و تجزیه فنل مشخص می گردد.
طراحی آزمایش Burman-Plackett براساس مدل زیر استوار است:
معادله ٣-۱- Y=β0+ΣβXi
در این مدل 0Ү پاسخ ( رشد باکتری و تجزیه فنل که به شکل واحد U بیان می گردد) 0β ثابت مدل، iβ ضریب خطی ،Xi سطح یا مقدار ابتدایی متغیر است.در این مدل امکان بررسی اثرات متقابل فاکتورهای تاثیر گذار بر پاسخ وجود ندارد و صرفا برای غربالگری و ارزیابی فاکتورهای مهم تاثیرگذار بر پاسخ کاربرد دارد. هر آزمایش تکرار شد و میانگین پاسخ ها بعنوان پاسخ نهایی در نظر گرفته شد.با بررسی آنالیز رگرسیون متغیر ها ، فاکتورهای تاثیرگذار (معنادار) (۰۵/۰p) برای تولید طی بهینه سازی بعدی به روش RSM مورد استفاده قرار گرفتند(۴۷).

براساس برنامه ریزی انجام شده به روش Burman-Plackett به شرح ذیل۱۲مجموعه آزمایشی به منظور بهترین منبع کربن کمکی (فنل) و ازت (آمونیوم سولفات ، سدیم کلرید ، پپتون ، عصاره مخمر) طراحی گردید ( جدول٣-٤و٣-۵).
جدول۳-۴-طراحی آزمایش Burman-Plackett براساس مقادیر کد شده
Run
فنل
g/l
آمونیوم سولفات
g/l
سدیم کلرید
g/l
پپتون
g/l
مخمر
g/l
منیزیم سولفاتg/l
۱
۱-
۱-
۱
۱
۱-
۱
۲
۱-
۱
۱
۱
۱-
۱-
۳
۱
۱-
۱
۱-
۱-
۱
۴
۱
۱
۱
۱
۱
۱
۵
۱-
۱-
۱-
۱
۱
۱
۶
۱
۱
۱-
۱-
۱-
۱
۷
۱-
۱
۱
۱-
۱
۱-
۸
۱-
۱
۱-
۱-
۱
۱
۹
۱
۱-
۱
۱-
۱
۱-
۱۰
۱
۱-
۱-
۱
۱
۱-
۱۱
۱-
۱-
۱-
۱-
۱-
۱-
۱۲
۱
۱
۱-
۱
۱-
۱-
Run
فنل
g/l
آمونیوم سولفاتg/l
سدیم کلرید g/l
پپتون
g/l
مخمر
g/l
منیزیم سولفات g/l
۱
۵/۰
۱/۰
۰۰/۱
۵/۰
۱/۰
۳/۰
۲
۵/۰
۵/۰
۰۰/۱
۵/۰
۱/۰
۱/۰
۳
۹/۰
۱/۰
۰۰/۱
۱/۰
۱/۰
۳/۰
۴
۹/۰
۵/۰
۰۰/۱
۵/۰
۵/۰
۳/۰
۵
۵/۰
۱/۰
۵/۰
۵/۰
۵/۰
۳/۰
۶
۹/۰
۵/۰
۵/۰
۱/۰
۱/۰
۳/۰
۷
۵/۰
۵/۰
۰۰/۱
۱/۰
۵/۰
۱/۰
۸
۵/۰
۵/۰
۵/۰
۱/۰
۵/۰
۳/۰
۹
۹/۰
۱/۰
۰۰/۱
۱/۰
۵/۰
۱/۰
۱۰
۹/۰
۱/۰
۵/۰
۵/۰
۵/۰
۱/۰
۱۱
۵/۰
۱/۰
۵/۰
۱/۰
۱/۰
۱/۰
۱۲
۹/۰
۵/۰
۵/۰
۵/۰
۱/۰
۱/۰
جدول۳- ۵- طرح آزمایش بر اساس مقادیر واقعی
برای این ١٢ آزمایش طراحی شده ،١٢ارلن انتخاب شد و در داخل هر یک از ١٢ارلن آب مقطر اضافه شد و مقادیر مشخص شده در جدول برای فنل ، آمونیوم سولفات ، سدیم کلرید ، پپتون ، مخمر و منیزیم سولفات به ترتیب اضافه شدو ارلن های محتوی نمونه ها در داخل اتوکلاو در دمای ١٢١درجه سانتی گراد استریل شدند وباکتری ها در کنار شعله درهر یک از این محیط ها ،کشت داده شدندو سپس هرکدام را در دمای ٣٠درجه سانتی گراد به مدت ٢٤ساعت در داخل انکوباتور قرار گرفت.برای هر نمونه شاهدی در نظر گرفته شد.سپس در دستگاه اسپکتروفتومتر جذب نوری نمونه در طول موج ٦٠٠نانومتر خوانده شد.
٣-۶-٢-بهینه سازی آماری به روش RSM:
با این روش می توان اثرات اصلی را بر رشد باکتری و تجزیه فنل ارزیابی نمود.طراحی مرکب از ۴ متغیر مستقل شامل آمونیوم سولفات (۱C)، غلظت فنل (۲C)، Hp (٣C)، دمای انکوباسیون (۴C) تشکیل گردید.برای هر فاکتور نسبت به صفر ، مقادیری تعیین گردید که به آن ها مقادیر کد شده اتلاق می گردد.با استفاده از این ۴ فاکتور و ۵ سطح کد شده، ٣٠ آزمایش طراحی گردید(جدول٣-٨و٣-٧).داده های حاصل از آزمایش در معادله با بررسی اثرات هر فاکتور به تنهایی و اثرات متقابل هر متغیر، پیشگویی گردید.معادله ٣-۲-
Y=a_0+∑_(i=1)^٣▒〖a_i Ci〗+∑_(i=1)^٣▒〖a_ii Ci〗 ²+∑_(i=1)^۲▒〖∑_(j=i+1)^٣▒〖a_ij Ci〗 Cj〗_

در این معادله پاسخ پیش بینی شده ( به شکل واحد (U) بیان می گردد)، 0a ثابت مدل ، ia ضریب خطی، iia اثرات مربع (هر متغیر) ، ija اثرات متقابل وiC وjC و… متغیرها هستند. از این معادله برای بهینه سازی مقادیر پارامترهای مستقل تاثیر گذار بر پاسخ استفاده می شود.
برای تعیین آنالیز رگرسیون چندگانه و ترسیم پلان سطح پاسخ و انجام آنالیز واریانس از نرم افزار Minitab استفاده شد(۴٨).

٣-۷-تعیین صحت مدل سطح پاسخ
بدین منظور پس از تعیین بهترین مقادیر (طی پیشگویی نرم افزار) رشد باکتری و تجزیه فنل به طور تجربی مورد آزمایش قرار گرفت و نتایج حاصله با نتایج پیشگویی مورد مقایسه قرار گرفت.
٣-٨-آنالیز آماری
نتایج به صورت انحراف معیار mean±SD ارائه شد.احتمال٠۵/٠ p از نظر آماری معنادار تلقی گردید(۴٩).

جدول ٣-۶- مقادیر کد شده و حقیقی در روش طراحی آزمایش RSM
فاکتور کد
واحد
-2
-1
0
1
2
Ammonium sulfate
)g/l)
0.05
0.20
0.35
0.50
0.65
phenol concentration
(g/l)
0.30
0.50
0.70
0.90
1.10
pH

4.50
5.50
6.50
7.50
8.50
Temperature degree
(°c)
24.00
30.00
36.00
42.00
48.00

دما (°c)
pH
غلظت فنل
g/l
آمونیوم سولفات
g/l
شماره


دیدگاهتان را بنویسید