منبع پایان نامه ارشد درمورد آنتي، وکتور، پروتئين

OD600 محيط به 6-2 برسد (حدود 18-16 ساعت).
2. محيط کشت فوق را در g3000 به مدت 5 دقيقه سانتريفوژ نموديم.
3. رسوب سلولي را در 30 ميلي ليتر محيط BMMY (پيوست 1)، اختصاصي جهت بيان پروتئين هاي نوترکيب با اتانول حل نموده و مجدداً براي ادامه رشد در انکوباتور قرار داديم.
4. پس از گذشت 24 ساعت، از متانول 100% به غلظت نهايي 5/0% به محيط اضافه نموديم تا بيان پروتئين القاء گردد.
5. پس از گذشت مدت زمان 96 ساعت از شروع کشت، محيط بياني را در دور rpm6000 به مدت 5 دقيقه سانتريفوز مينماييم.
6. محلول رويي را به تيوب جديد منتقل نموده و پس از اندازه گيري غلظت پروتئيني در 280 نانومتر، اقدام به تغليظ اين محلول به منظور بررسي با SDS-PAGE مي نماييم.
7. محلول فوق را با عبور از فيلترهاي Centriprep YM50 بر طبق دستورالعمل شرکت سازنده تغليظ مي نماييم.
2-7-6-2 بررسي بيان پروتئين نوترکيب با روش SDS-PAGE
• ژل SDS-PAGE 15% بر اساس روش ذکر شده در بخش2-6-10 تهيه گرديد.
• پس از انجام الکتروفورز و رنگ آميزي ژل، ميزان بيان پروتئين نوترکيب با روش کوماسي بلو بر اساس شدت باند حاصله مورد بررسي قرار گرفت.
2-7-7 تزريق نمونه پروتئيني به خرگوش
توليد آنتي بادي پلي كلونال به روشهايي براي معرفي يك ايمونوژن به حيوان و خونگيري براي سنجش ميزان آنتي بادي نياز دارد. انتخاب حيوان بستگي به امكانات موجود در نگهداري حيوان، ميزان آنتي سرم مورد نياز و ميزان ايمونوژن موجود، دارد. پاسخ ايمني بهتر، عموماً زماني بدست مي آيد كه از يك ادجوان مناسب در اولين ايمني زايي استفاده گردد. براي اين منظور، ايمونوژن بصورت يك امولسيون آب و روغن آماده مي شود كه حاوي ميكوباكتريوم كشته شده با حرارت مي باشد كه تحت عنوان آدجوان كامل فروند معرفي مي گردد. استفاده از اين امولسيون فرد را مطمئن مي كند كه آنتي ژن به آرامي در جريان خون حيوان آزاد مي شود و از طرفي باكتريهاي كشته شده ميكوباكتريوم، سيستم ايمني حيوان را تحريك مي كنند. ايمن سازي هاي بعدي، براي افزايش سطح آنتي بادي لازم اند و در بافر فسفات سالين (PBS) يا در امولسيون روغني (ادجوان ناقص فروند ) مصرف مي شوند (Johnstone, 1996).
روشهاي مختلفي براي تزريق ايمونوژن وجود دارد (Johnstone, 1996) كه عبارتند از :
1) درون ماهيچه اي (i.m=Intra muscular)
2) درون رگي (i.v = Intra venous)
3) درون پوستي (i.d = Intra dermal)
4) درون صفاقي (i.p = Intra peritoneal)
5) زير پوستي (s.c = Sub cutaneous)
ايمن سازي درون پوستي يك روش مؤثر در ايجاد پاسخ اوليه است. روشهاي i.m و i.d و يا s.c بهتر است در چندين محل مختلف صورت گيرند.
در مورد خرگوشها، در اولين ايمن سازي به ?g200-50 پروتئين در FCA نياز است كه بايد به صورت درون پوستي به 8-6 جاي مختلف از پشت حيوان تزريق گردد. تزريقهاي بعدي با فاصله 28 روز يا بيشتر، با 200-50 ميكروگرم پروتئين آماده شده در PBS يا FIA به فرم i.m يا i.v يا s.c صورت مي گيرد (Johnstone, 1996).
1) اولين تزريق:
• براساس غلظت نمونه پروتئيني مورد نظر (پروتئين GCSF نوترکيب موجود در بازار دارويي (ساخت شرکت پويش دارو)، ?l85 از ويال (200 ميکروگرم) را برداشته و با ?l415 از PBS استريل مخلوط كرده و آن را با ?l500 ادجوان كامل فروند مخلوط كرده و با emulsifier آنقدر اين دو ماده را مخلوط كرديم تا شيري رنگ و سفت شد.
• قبل از اولين تزريق،ml 1 خون از حيوان گرفته شد تا به عنوان كنترل منفي (قبل از تزريق) از آن استفاده شود.
• اين نمونه در rpm1500 به مدت 5 دقيقه سانتريفوژ گرديد و سرم از گلبول هاي قرمز جدا گرديد. سرم را در تيوب جديد ريخته و در 20- درجه سانتيگراد نگهداشتيم.
• محلول آماده شده از آنتي ژن در FCA به 8 جاي مختلف از پشت خرگوش به صورت درون پوستي تزريق گرديد.
2) دومين تزريق:
• سي روز پس از اولين تزريق، دومين تزريق به خرگوش با?l 85 از نمونه پروتئيني (200 ميکروگرم) در ?l415 PBS استريل با ?l 500 ادجوان ناقص فروند مجدداً به صورت درون پوستي صورت گرفت.
• 30 روز بعد، ml1 خون از حيوان گرفته شد تا از نظر ايمني زايي تزريقهاي فوق با روش ايمونوبلاتينگ، مورد بررسي قرار بگيرد.
2-7-8 ايمونوبلاتينگ
براي شناسايي پروتئين هاي اختصاصي از طريق آنتي بادي هاي پلي كلونال يا مونو كلونال، از لكه گذاري ايمني استفاده مي شود. در روش لكه گذاري ايمني نمونه هاي پروتئيني در حضور ماده SDS و عوامل احياء كننده (مانند 2- مركاپتواتانول) الكتروفورز شده و سپس از روي ژل به غشاء نيتروسلولزي يا نايلوني منتقل مي گردند و با استفاده از آنتي بادي هاي نشاندار شده شناسايي مي شوند. براي انتقال پروتئين ها از ژل به غشاء از روش هايي مانند روش تانك و يا روش نيمه خشك استفاده مي شود. در روش انتقال با تانك، از بافر حاوي تريس -گلايسين و متانول استفاده مي شود كه متانول علاوه بر اينكه از تورم ژل جلوگيري مي كند، باعث جدا شدن SDS از پروتئين ها شده و بازده اتصال پروتئين به غشاء را افزايش مي دهد. در روش انتقال نيمه خشك، ساندويچ انتقال پس از خيس شدن در بافر انتقال، بين دو الكترود بزرگ گرانيتي قرار گرفته و عمل انتقال انجام مي گيرد (Sambrook, 2001).
در اينجا روش انتقال با روش نيمه خشك توضيح داده مي شود.
مواد لازم
– غشاء نيتروسلولز با منافذ 45/0 ميكرومتري
– كاغذ واتمن
– بافر انتقال (شامل تريس بازي، گلايسين، متانول و آب مقطر مي باشد، پيوست 8).
– دستگاه Semidry
– رنگ پانسوS
روش انجام كار
• نمونه پروتئيني در مجاورت ماركر پروتئيني با روش SDS-PAGE، الكتروفورز شد.
• به مدت 30 دقيقه ژل در بافر انتقال قرار داده شد تا از تغيير حجم ژل در هنگام انتقال جلوگيري شود.
• غشاي نيترو سلولزي را به اندازه ژل برش زده و در بافر انتقال قرار مي دهيم.
• چندين لايه كاغذ واتمن (هم اندازه با ژل) را در ظرف حاوي بافر انتقال، مرطوب کرده و سپس كاغذ ها روي صفحه گرانيتي دستگاه بلاتينگ با سيستم نيمه خشك گذاشته شد ( با غلتاندن يك ميله شيشه اي حباب هاي احتمالي بين كاغذها خارج گرديد).
• غشاي نيترو سلولز خيس شده به آرامي به گونه اي كه حبابي تشكيل نگردد بر روي كاغذ هاي واتمن قرار داده شد. سپس ژل مورد نظر را را به گونه اي كه حباب تشكيل نگردد به آرامي روي کاغذ قرار داديم.
• مجدداً چند لايه كاغذ واتمن خيس شده در بافر انتقال، روي ژل قرار داده شد و با غلتاندن ميله شيشه اي، حباب هاي احتمالي را خارج نموديم.
• درب دستگاه را بسته و دستگاه را به جريان برق متصل نموديم و با توجه به اندازه پروتئين، ولتاژ ثابت و زمان انتقال دستگاه تنظيم شد.
• پس از اتمام زمان انتقال، كاغذ نيتروسلولز با رنگ پانسوS رنگ آميزي شد تا باندهاي پروتئيني ظاهر گردند. از طرفي باندهاي ماركر پروتئيني نيز علامت گذاري گرديدند. سپس غشاء با آب مقطر شسته شد تا رنگ پانسوS آن از بين برود.
• غشاء نيتروسلولز به مدت 1 ساعت در دماي اتاق بر روي شيکر در بافر بلوكه كننده قرار گرفت. سپس به مدت 16 ساعت در 4 درجه سانتيگراد قرار داده شد.
نكته: به منظور بلوكه كردن غشاء در نواحي كه فاقد پروتئين است مي توان از شير خشك بدون چربي و يا آلبومين سرم گاوي (BSA) محلول در بافر PBS داراي توئين20 استفاده كرد.
• آنتي بادي اوليه، سرم خرگوشي رقيق شده به نسبت 1 به 500 در PBS بود. اين آنتي بادي به مدت 2 ساعت در دماي اتاق بر روي غشاء بر روي شيكر انكوبه شد.
• غشاء 5 بار 10 دقيقه اي در TTBS بر روي شيكر شسته شد.
• آنتي بادي دوم، Goat anti Rabbit IgG كونژوگه با HRP بود كه به نسبت 1 به 1000 در PBS رقيق شده بود. اين آنتي بادي به مدت 1 ساعت بر روي غشاء بر روي شيكر انكوبه شد.
• بعد از اتمام زمان انکوباسيون در آنتي بادي ثانويه، كاغذ پنج بار 10 دقيقه اي با PBS حاوي 05/0% توئين 20 شستشو داده شد.
• كاغذ به مدت 10 دقيقه با بافر PBS بدون توئين شستشو داده شد.
• كاغذ نيتروسلولز در محلول سوبستراي آنزيم نشاندار (DAB) گذاشته شد تا باندهاي مورد نظر نمايان گردند.
• پس از نمايان شدن باندها، كاغذ با آب مقطر چند بار شستشو داده شد و سپس كاغذ را خشك كرده و در جاي تاريك نگهداري گرديد.
فصل سوم نتايج
3-1 سنتز ژن gcsf
cDNA کد کننده پروتئين GCSF پس از بهينه سازي کدونها براي بيان در سلول مخمري به يکي از شرکت هاي مرتبط سفارش داده شد و توالي سنتز شده در وکتور کلونينگ pGH به گروه تحويل داده شد (شکل 3-1).
شکل 3-1 طرح شماتيک وکتور کلونينگ حاوي ژن gcsf
3-1-1 PCR اختصاصي بر روي ژن gcsf
3-1-1-1طراحي پرايمرهاي اختصاصي ژن gcsf
با توجه به اين که جايگاه برش آنزيم‌هاي BamH? و HpaI در توالي ژن هدف، gcsf، و نيز وکتور بياني طراحي شده وجود ندارد، اين دو جايگاه بر روي توالي پرايمرهاي F و R تعبيه شدند. طراحي پرايمرها با بررسي نکات کليدي در زمينه عدم تشکيل فرم سنجاق سري ، دايمرهاي پرايمري و ساير ساختارهاي ثانويه با استفاده از نرم‌افزار genrunnr انجام شد. نتايج حاصل از بررسي پرايمرها در اين نرم‌افزار در شکل‌هاي 3-2 الف و ب آورده شده است.
(الف) (ب)
شکل3-2 بررسي توالي پرايمرهاي F (الف) و R (ب) ژن gcsf.
3-1-1-2 بهينه ‌سازي واکنش PCR
گراديان PCR بهترين دماي اتصال پرايمرها و تکثير ژن gcsf را 60 درجه سانتي گراد نشان داد (شکل 3-3).
شکل 3-3 PCR گراديان ژن مقاومت به gcsf
چاهک 7-1: محصول PCR در دماهاي 50 تا 60 درجه سانتي گراد
چاهک 5: مارکر DNA (kb1)
چاهک 8: کنترل منفي PCR
3-2 کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بياني هانسونلا
3-2-1 هضم آنزيمي وکتور کلونينگ pGH-gcsf و وکتور بياني pHan
به دنبال هضم آنزيمي اين وکتورها با آنزيمهاي BamHI و HpaI، در مورد وکتور کلونينگ، بر روي ژل آگارز قطعه ژني gcsf به طول تقريبي bp615 و وکتور کلونينگ pGH به طول تقريبي bp2900 مشاهده شد در حاليکه در مورد وکتور بياني، وکتور خطي شده اي به طول حدوداً 6500 نوکلئوتيد بر روي ژل ظاهر گرديد (شکل 3-4).
شکل 3-4 هضم آنزيمي وکتورهاي pGH-gcsf و pHan با آنزيم هاي HpaI و BamHI
چاهک 1: مارکر DNA (kb1)
چاهک 2: وکتور هضم نشده pGH-gcsf
چاهک 3: وکتورpGH-gcsf هضم شده با HpaI و BamHI (ژن gcsf به طول bp615)
چاهک 4: وکتور هضم نشده pHan
چاهک 5: وکتور pHan هضم شده با HpaI و BamHI (به طول تقريبي bp6500)

Author: y7oozita

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *