منبع پایان نامه ارشد درمورد توليد، GCSF، بياني

ه مي شوند. به همين دليل، توليد آنتي ژن HBS هترولوگ در سيستم هاي بياني مختلف از جمله مخمر، باکتري، سلولهاي گياهي يا جانوري و نيز حيوانات تراريخته توسعه پيدا نمود. (Billman-Jacobe, 1996, Makrides, 1996).
1-10 مخمرها به عنوان ميکروارگانيسم هاي توليدي
سيستم هاي مخمري داراي مزايايي از جمله توانايي دستکاري ژنتيکي آسان، فرآيند هاي پس از ترجمه يوکاريوتي با ميزان بالاي توليد محصول و فرآيندهاي تخميري ارزان قيمت هستند. بنابراين تعجب آور نيست که ساکاروميسس سرويزيه به عنوان يکي از ميزبانهاي مطلوب در توليد پروتئين هاي هترولوگ شناخته شده است (Hinnen et al, 1995; Barr et al, 2000).
تاکنون دو روش در سيستم بياني هانسونلا پلي مورفا به منظور توليد زيرواحدهاي adw2 و adr از آنتي ژن HBs ابداع شده است که يکي از آنها توسط سازمان بهداشت جهاني (WHO) تأييد شده است (Gregg et al, 1985; Gregg and Madden, 1987).
1-10 ساخت سويه هانسونلا پلي مورفا بيان کننده آنتي ژن HBs
به طور کلي توليد سويه هاي هانسونلا پلي مورفا نوترکيب نيازمند دنبال کردن پروتکل استاندارد زير است:
1. توليد کاست بياني و وکتور پلاسميدي
2. انتقال وکتور طراحي شده به سلول هانسونلا پلي مورفا
3. جداسازي سويه هاي نوترکيب
1-10-1 توليد کاست بياني و وکتور پلاسميدي
توليد سويه H415 بيان کننده آنتي ژن HBs بوسيله گروهي از محققين يک مثال از اين فرآيند است. توالي کدکننده آنتي ژن به طول 683 نوکلئوتيد از پلاسميد pRIT10616 جدا گرديد (Harford et al, 1987) و قطعه پروموتريMOX به عنوان سيگنال براي رونويسي از ژن MOX هانسونلا پلي مورفا مشتق شد (Ledeboer et al, 1985; Eckart 1988). اين سه عنصر ترکيب شده و قطعه MOX promoter-HBsAg gene-MOX terminator را تشکيل مي دهند که اساس کاست بياني مي باشند (Stinchcomb et al, 1980). سپس اين کاست داراي عملکرد بياني درون وکتور پلاسميدي حاوي عناصر زير قرار داده شد. ژن مقاومت به کلرامفنيکل به منظور تکثير در باکتري E. coli، توالي همانند سازي هانسونلا پلي مورفا (HARS1) و ژن URA3 از ساکاروميسس سرويزيه به عنوان مارکر انتخابي14 در بررسي انتقال پلاسميد به هانسونلا پلي مورفا مي باشند.
پلاسميدهاي داراي توالي HARS1 توانايي بالايي براي ادغام در ژنوم ميزبان دارند. امروزه سويه هايي شناسايي شده که داراي بيش از 60 کپي از کاست بياني خارجي اند که اين مطلب به دليل وجود اين توالي مي باشد.
1-11 انتقال (ترانسفرم) وکتورهاي بياني به هانسونلا پلي مورفا
1-11-1 روش پلي اتيلن گليکول
پلاسميدpRBS-269 با استفاده از روش پلي اتيلن گلايکول به سويه RB10 انتقال يافت و براي مشخص شدن ادغام پلاسميد به درون ژنوم، غربالگري صورت گرفت (Gregg et al, 1985).
تاکنون چندين سويه ترانسفرم شده با کاست هاي بياني الحاقي بطور پايدار توليد شده است و سويه H415 يکي از اين سويه هاست که براي بيان آنتي ژن HBs تحت شرايط خاص مورد آزمايش قرار گرفته است (Janowicz et al, 1991).
1-12 جداسازي سويه هاي نوترکيب
تشخيص بيان پروتئين با رشد سويه هاي ترنسفورم شده بر روي محيط هاي تقريباً مغذي حاوي گلوکز، گليسرول و يا متانول بررسي مي شود. در اين راستا، مقدار آنتي ژنHBs توليد شده در اين سيستم بياني در مقايسه با مقدار استاندارد آنتي ژن خالص با روش ايمونوبلاتينگ کمي اندازه گيري شد. ميزان توليد د ر سويه H415 در محيط کشت حاوي متانول mg100 بود. زمانيکه سلول ها در محيط حاوي گليسرول قرار گرفتند سنتز آنتي ژن HBs 70% کاهش پيدا کرد و زمانيکه سلول ها به محيط حاوي گلوکز منتقل شدند آنتي ژني توليد نگرديد که اين مطلب نشان دهنده توليد اين آنتي ژن به طور طبيعي تحت کنترل ژن MOX ميباشد (Rutgers et al, 1988).
1-13 تنظيم متابوليسم متانول
تنظيم آنزيم هاي احياکننده15 به روش مهاري و نه القاء صورت مي پذيرد. در طي فرايند رشد، در شرايط کمبود گلوکز اين آنزيم ها افزايش پيدا مي کنند (Egli, 1980). تجزيه و تحليل منطقه پروموتر ژن کد کننده AOD نشان داده است که در H. polymorpha بيان ژن MOX نيز توسط يک مکانيسم مهاري تنظيم مي شود (Roggenkamp, 1984; Sakai and Tani, 1992).
1-14 فاکتور محرک رشد کلني گرانولوسيتي16 (G-CSF)
در دهه 60 ميلادي، دو گروه به طور همزمان روش هايي را براي توسعه و بهبود رشد کلني هاي گرانولوسيتي و مونوسيتي مغز استخوان موش و يا سلول هاي طحال بر روي آگار نيمه جامد مورد بررسي قرار دادند. رشد کلني اين سلولها به حضور فاکتورهايي بستگي دارد که اصطلاحاً آنها را فاکتورهاي محرک رشد کلني(CSF) مي نامند. تلاش براي شناخت بيولوژيکي و بيوشيميايي اين محرکها آزمايشگاههاي زيادي را تا اواسط دهه 80 ميلادي درگير کرده بود (Metcalf, 2010). اين تحقيقات نشان دادند که CSF ها عملکردي اختصاصي و مجزا ندارند بلکه چهار CSF که از نظر بيوشيميايي کاملاً متفاوت هستند با هم همکاري مي کنند. اين چهار CSF با توجه به نوع فعاليت شان بر روي کلني هاي متفاوت، نامگذاري شدند. به طور مثال GM-CSF که محرک رشد کلني ماکروفاژها و گرانولوسيت ها مي باشد.M-CSF محرک توليد کلني ماکروفاژها و G-CSF محرک رشد کلني گرانولوسيتي مي باشد.
1-15 ژن gcsf
اين ژن بر روي کروموزوم 17 قرار گرفته و داراي 4 اينترون است. دو نوع پلي پپتيد متفاوت در نتيجه پردازش هاي مختلف از اين ژن ايجاد مي شود. تفاوت اين دو پلي پپتيد در وجود و يا عدم وجود 3 اسيد آمينه مي باشد. مطالعات انجام گرفته بر روي بيان اين دو نشان مي دهد که هر دوي آنها داراي فعاليت هاي مربوط به GCSF مي باشند.
1-16 پروتئين GCSF
فاکتور محرک رشد کلني گرانولوسيتي (GCSF)که فاکتور محرک کلني317 هم ناميده مي شود، يک سيتوکين وهورمون محرک رشد و داراي 175 اسيد آمينه مي باشد. گليکوپروتئين هاي طبيعي انساني در دو فرم وجود دارند. 174 آمينو اسيدي و 180 آمينو اسيدي که پروتئيني طويل با وزن مولکولي 19600 دالتون مي باشد. فرم 174 آمينو اسيدي بيشترين فعاليت را دارد که در محصولات دارويي به کمک تکنولوژي DNA نوترکيب ساخته مي شود. اين فاکتور در بافت هاي مختلف اثربخشي خود را از طريق تحريک مغز استخوان براي ساخت گرانولوسيت و سلولهاي بنيادي انجام مي دهد.GCSF همچنين توسط اندوتليوم، ماکروفاژها و تعدادي از سلولهاي ايمني توليد مي شود.
شکل 1-4 ساختار کريستالي از 3 مولکول G-CSF انساني
1-17 عملکرد پروتئين GCSF
G-CSF مغز استخوان را براي انتشار گرانولوسيت و سلولهاي بنيادي در خون تحريک مي کند. اين پروتئين همچنين باعث تحريک بقاء، تکثير، تمايز و عملکرد پيش سازه هاي نوتروفيلي و نوتروفيل هاي بالغ مي شود که تنظيم اين واکنش ها از طريق Janus kinase (JAK)، مبدل سيگنال و فعال کننده رونويسي STAT، پروتئين کيناز ميتوژني فعال (MAPK) و فسفاتيديل اينوزيتول-3-کيناز انجام ميشود.
شکل 1-5 مکانيسم عملکرد GCSF
گيرنده هاي GCSF بر روي سلول هاي پيش ساز مغز استخوان قرار دارند و در پاسخ به GCSF تحريک مي شوند و اين باعث رشد و تمايز اين سلول ها به گرانولوسيت بالغ مي شود. اين پروتئين همچنين يک القاء کننده قوي براي انتقال سلول هاي بنيادي خون ساز هماتوپويتيک از مغز استخوان به درون خون مي باشد (Wonganu, 2008).
GCSF همچنين محرک توليد گلبولهاي سفيد خون نيز مي باشد و در انکولوژي و هماتولوژي، در بعضي سرطان هاي خاص براي افزايش سرعت بهبودي افراد نوتروپني بعد از شيمي درماني از شکل نوترکيب آن استفاده مي شود. شيمي درماني سبب توليد سطح غير قابل قبول (کم) سلولهاي سفيد خون مي شود که اين مورد بيماران را در مقابل حملات ميکروبي و عفونت ها حساس مي نمايد.
به نظر ميرسدGCSF براي يک بارداري امن در طي مرحله لانه گزيني مؤثر باشد که اين امر در بارداري هاي دوم و سوم بيشتر مي شود (Strife, 2013).
در کنار تاثير بر روي سيستم خون سازي، GCSF همچنين مي تواند بر روي سلول هاي عصبي به عنوان مثال فاکتور نوتروفيک تأثير بگذارد. در واقع گيرنده هاي اين گليکوپروتئين بر روي نورون هاي مغز و نخاع ظاهر مي شوند (Cooper, 2011).
همچنين از GCSF براي درمان تخريب بافت قلب از طريق تزريق در خون محيطي به همراهSDF stromal) (cell-derived factor استفاده مي شود (Anderlini, 2005) .
امروزهGCSF نوترکيب انساني در سيستم بياني باکتري E. coli توليد مي شود که با نام فيلگراستيم شناخته شده است. فيلگراستيم از لحاظ ساختاري تفاوت کمي با گليکوپروتئين طبيعي GCSF دارد. فيلگراستيم (Neupogen) و فيلگراستيم پگيله شده (Neulasta) (PEG-filgrastim) دو نوع تجاري متداول فرم نوترکيب GCSF انساني rhG-CSF هستند. فرم پگيله، نيمه عمر طولاني تري دارد و اين موضوع سبب کاهش ضرورت تزريق روزانه اين دارو مي شود.
شکل ديگر GCSF نوترکيب انساني در سلولهاي تخمدان هامستر چيني (CHO cells) ساخته مي شود که با نام لنوگراستيم شناخته مي شود. از آنجا که اين سيستم بياني در سلول پستانداران مي باشد، لنوگراستيم توليدي تفاوت بسيار کمي (غير قابل تشخيص) در 174 آمينو اسيد با GCSF طبيعي انسان دارد.
براي اولين بار در سال 1999 در آکادمي بيوتکنيک چين، ژنوم انسان به عنوان رشته الگو براي کلونينگ و بيان GCSF در غدد پستاني موش استفاده شد و قطعه اي به طول 5/1 کيلوباز با PCR بدست آمد(Lu, 1999).
در سال 2009 محققين به بيان پروتئين نوترکيب GCSF در مخمرPichia Pastoris پرداختند که نتيجه اين تلاش بيان اين پروتئين تحت پروموتور AOX1 بوده که در نتيجه القاء با متانول ميزان پروتئين شده به 2 ميلي گرم در ليتر رسيد (Apte-Deshpande, 2009).
در سال 1387 محققين ايراني به جهش زايي هدفمند در فاکتور محرک رشد کلني گرانولوسيت انساني و کلونينگ و بيان آن در باکتري E. coli پرداختند و نتايج آنها نشان داد که پروتئين نوترکيب مورد نظر با موفقيت در سيستم پروکاريوتي کلون و بيان شده است (حامد ناقوسي، 1387).
به دليل اهميت باليني بالا و نيز نياز گسترده به GCSF در مراقبت هاي بهداشتي، تلاش هاي زيادي به منظور توليد مولکولهاي مشابه با فرم طبيعي انساني آن که داراي عملکرد باشند در حال انجام است.
در سالهاي گذشته محققين ايراني سعي در بيان آن در کاهوي تراريخته داشتنه اند چراکه در اين سالها گياهان تراريخته براي توليد انواع داروي نوترکيب و واکسن ها مورد استفاده قرار گرفته اند (مهدي شريفي تبار،1392).
فصل دوم مواد و روش ها
2-1 ميکروارگانيسم هاي مورد استفاده
از باکتري E. coli سويه ‘ TOP10F به منظور کلونينگ و تکثير پلاسميدها و از مخمر Hansenula polymorpha سويه RB11 به عنوان ميزبان بياني مخمري استفاده شد.
2-2 محيط هاي کشت مورد نياز
جهت رشد باکتري‌ E. coli از محيط کشت LB جامد يا مايع و جهت رشد مخمر از محيطهاي کشت YPD جامد يا مايع، BMMY و BMGY استفاده شد (پيوست 1).
پس از آماده نمودن محيط¬هاي كشت ميکروبي مورد نياز، اين محيط ها در دماي 121 درجه سانتيگراد به مدت 15 دقيقه در فشار يك اتمسفر اتوكلاو گرديدند. محلول‌هاي قندي يا محلولهاي حساس به اتوكلاو با استفاده از فيلترهاي 22/0 ميکرون استريل شدند.
2-3 پلاسميدهاي مورد استفاده
وکتور کلونينگ pGH براي کلون نمودن ژن سنتز شده gcsf توسط شرکت مربوطه مورد استفاده قرار گرفت (شکل 3-1). وکتور بياني مورد نياز براي سلولهاي مخمري به صورت سنتتيک و با درج عناصر ضروري جهت بيان پروتئين هاي هترولوگ در اين سلولها با استفاده از وکتور کلونينگ pGH به عنوان وکتور اوليه

Author: y7oozita

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *