منبع پایان نامه ارشد درمورد دقيقه، دماي، تيوب

ساخته شده است.
شکل 3-1. وکتور کلونينگ pGH
2-4 آنزيم ها و کيت‌ها
آنزيم Taq DNA polymerase، آنزيم هاي محدودالأثر، RNaseA و آنزيم T4 DNA ligase از شرکت Fermentas تهيه شدند.
کيت استخراج محصول PCR يا DNA از ژل آگارز از شركت Roche تهيه گرديد.
2-5 آنتي بيوتيکها
آنتي بيوتيک ها (آمپي سيلين، تتراسايکلين و زئوسين) با غلظت مناسب (پيوست 2) تهيه و در 20- درجه سانتيگراد نگهداري شدند.
2-6 روش هاي عمومي
2-6-1 الکتروفورز افقي محصول PCR و يا نمونه DNA بر روي ژل آگارز
به منظور بررسي نتايج PCR و يا کيفيت هرنوع مولکول DNA، از ژل آگارز استفاده مي شود. به همين جهت ابتدا ژل آگارز با غلظت متناسب با سايز مولکول مورد بررسي تهيه مي شود. با توجه به ظرفيت کاست ژل، ابتدا پودر آگارز وزن شده و سپس در حجم مشخصي از بافر TAE (پيوست 3) با رقت X1 حل مي گردد. اين مخلوط به مدت 10 دقيقه در دماي اتاق باقي مانده و سپس مخلوط به مدت 1 دقيقه جوشانده مي شود تا به خوبي حل شده و محلول يکنواختي حاصل شود. پس از کاهش دماي محلول تا حدود °C40، به ميزان لازم از محلول رنگي DNA Safety Stain به آن اضافه کرده و به آرامي به درون کاست ژل ريخته شده و شانه روي آن قرار داده مي شود. پس از چند دقيقه و پس از بستن کامل ژل، شانه به آرامي و به صورت عمودي از داخل آن خارج ‌شده و ژل به همراه کاست در داخل تانك الكتروفورز افقي حاوي بافر TAE (X1) قرار داده مي شود. در ادامه نمونه هاي DNA همراه با حجم مشخصي از بافر بارگذاري ، با ترتيب مشخص به آرامي به درون چاهك ها ريخته مي شود. سپس الکترودهاي تانک به منبع تغذيه متصل مي شود. پس از گذشت مدت زمان مشخص با توجه به اندازه قطعه، جريان برق قطع گشته و ژل از درون کاست خارج مي گردد. ژل را در معرض نور فرابنفش قرار داده و باندها را مشاهده مي نماييم.
نکته: در صورتي که قرار است DNA از ژل تخليص شود، به هيچ‌وجه نمي‌بايست به مدت طولاني در معرض اشعه فرابنفش قرار گيرد زيرا اين اشعه طول موج پاييني داشته و قادر است در توالي DNA جهش ايجاد کند.
2-6-2 تخليص محصول هضم آنزيمي با استفاده از کيت تخليص از ژل آگارز
جهت انجام کلونينگ، تخليص محصول هضمهاي آنزيمي فوق با استفاده از کيت تخليص از ژل (Roche) و بر اساس پروتوکل موجود در کيت به شرح زير انجام ‌شد:
1. به ازاي هر mg100 ژل آگارز بريده شده ، µl300 بافر 1 (Binding buffer) به هر تيوب اضافه گرديد.
2. تيوب ها به مدت 30-15 ثانيه ورتکس شده و سپس به مدت 10 دقيقه در دماي C°56 گرماگذاري شدند.
3. در اين مرحله به ازاي هر mg100 ژل اوليه، µl150 ايزوپروپانول به تيوب ها اضافه شده وسپس ورتکس گرديدند.
4. محتويات هر تيوب به يکي از ستون هاي کيت افزوده شده و اين مجموعه را با بالاترين سرعت (rpm13000) به مدت 30-60 ثانيه سانتريفوژ نموديم.
5. مايع زيرين دور ريخته شده و سپس µl500 بافر شستشو به هر ستون اضافه گرديد.
6. پس از سانتريفوژ در بالاترين سرعت به مدت 1 دقيقه، مايع زيرين دور ريخته شده و در اين مرحله µl250 بافر شستشو مجدداً اضافه گرديد.
7. پس از سانتريفوژ به مدت 1 دقيقه (در بالاترين سرعت)، هريک از ستون ها را به تيوب هاي 5/1 ميلي ليتري انتقال داده و µl35 آب ديونيزه به فيلتر ستون ها اضافه کرده و پس از انکوباسيون 5 دقيقه اي در دماي اتاق، هريک از تيوبها را مشابه با مراحل قبلي سانتريفيوژ نموديم.
2-6-3 واکنش ليگاسيون قطعات تخليص شده
واكنش ليگاسيون پس از تعيين غلظت وكتور و قطعه الحاقي تخليص شده از ژل آگارز، بر طبق واکنش مندرج در جداول مربوطه انجام گرفت. در نمونه کنترل منفي، وکتور خطي شده به تنهايي در يک واکنش ليگاسيون وارد گرديد. به عبارت ديگر، در اين واکنش به جاي قطعه DNA، آب ديونيزه به مخلوط واکنش اضافه گرديد. تمامي تيوب ها به مدت 16 ساعت (ON) در دماي °C4 گرماگذاري شدند. اين دما كمك مي‌كند تا تشكيل پيوندهاي هيدروژني بين انتهاهاي چسبنده آسان‌تر و با پايداري بيشتري انجام شود و آنزيم ليگاز نيز زمان كافي براي تشكيل پيوند فسفودي‌استري را خواهد داشت.
2-6-4 تهيه سلول‌ هاي مستعد ‘E. coli TOP10F به روش تيمار با کلريد کلسيم
باکتري مستعد، سلولي است که توانايي لازم براي وارد نمودن پلاسميد به درون خود را پيدا کرده است.
1. يک کلني از باکتري مورد نظر به مدت 3-2 ساعت در حضور تتراسايکلين در محيط LB مايع و در دماي °C37 بر روي شيکر با سرعت rpm 150 كشت داده شد تا جذب نوري محيط کشت در طول موج nm600 (OD600nm) به 6/0-4/0 رسيد.
2. محيط کشت در شرايط استريل (در كنار شعله) به ميکروتيوپ استريل منتقل شده و با سرعت rpm9000 به مدت 3 دقيقه سانتريفوژ شد.
3. محيط کشت دور ريخته شده و رسوب سلولي در µl720 كلريد سديم mM100 سرد استريل، حل شده و به مدت 20 دقيقه در يخ گذاشته شد.
4. پس از گذشت اين مدت، سوسپانسيون باکتريايي با دور rpm9000 و به مدت 3 دقيقه سانتريفوژ شده و مراحل 3 و 4 تکرار شدند.
5. رسوب باکتريايي حاصل در µl300 محلول کلريد کلسيم حل گرديد.
2-6-5 انتقال پلاسميد به سلول هاي مستعد (ترانسفورماسيون)
1. µl100 از سوسپانسيون سلول هاي مستعد به تيوپ استريل انتقال داده شد.
2. حجم مشخصي از پلاسميد و يا محصول ليگاسيون به سوسپانسيون باکتريايي اضافه شده و تيوب ها به مدت 30 دقيقه درون يخ قرار داده مي شوند.
3. بلافاصله تيوب ها به حمام آبي دماي °C42 منتقل شده و به مدت 90 ثانيه گرماگذاري شدند. پس از اتمام اين زمان سريعاً تيوب ها را به ظرف يخ منتقل نموديم.
4. ml 1 محيط کشت مايع LB به محتويات هر يک از تيوبها اضافه کرده و به مدت 1 ساعت در °C37 گرماگذاري گرديدند.
5. 100 تا 150 ميکروليتر از سوسپانسيون باکتريايي بر روي محيط کشت LB جامد حاوي آنتي بيوتيک هاي مناسب (آمپي سيلين، تتراسايکلين يا زئوسين) کشت داده شد و پليت ها به مدت 16 ساعت در دماي °C37 گرماگذاري شدند.
6. پس از گذشت اين مدت، از کلني هاي تشکيل شده بر روي محيط کشت جامد، ماتريکس سلولي تهيه گرديد.
2-6-6 بررسي کلونهاي نوترکيب به روش سريع
1. مقدار µl50 از محلول EDTA(10 ميلي مولار) به تيوبها اضافه کرده و حدود 70% از ماتريکس باکتريايي را در آن حل نموده و سوسپانسيون را ورتکس نموديم.
2. مقدارµl 50 از محلول NSS (پيوست 4) را به هر تيوب افزوده و به مدت 30 ثانيه ورتکس نموديم.
3. تيوب ها را به مدت 5 دقيقه در حمام آبي°C 70 گرماگذاري نموديم.
4. مقدار µl 5/1 از محلول KCl (4 مولار) به تيوب ها اضافه کرده و هر تيوب به مدت 30 ثانيه ورتکس گرديده و سپس به مدت 5 دقيقه بر روي يخ قرار داده شد.
5. محتويات هر سلول در دماي 4 درجه به مدت 3 دقيقه در g3000 سانتريفوژ گرديد.
6. مايع رويي هر تيوب به تيوب جديد منتقل شد و ميزان µl25 از آن بر روي ژل آگارز 1% برده شد.
2-6-7 PCR بر روي کلني هاي باکتريايي/ مخمري
با رعايت شرايط استريل، از کلني هاي رشد يافته بر روي پليت ماتريکس، مقداري باکتري برداشته و در مقداري آب ديونيزه استريل حل نموده و به مدت 5 دقيقه در بن ماري در حال جوش (100 درجه سانتي گراد) جوشانده و سپس از اين محلول بعنوان الگوي DNA براي انجام PCR بر اساس پروتوکل مندرج در قسمت مربوطه استفاده مي شود.
2-6-8 استخراج پلاسميد در مقياس کم
1. باکتري E. coli حاوي پلاسميد مورد نظر را به لوله ml5 محيط کشت LB مايع حاوي آنتي بيوتيک مناسب تلقيح کرده و به مدت 16 ساعت (ON) درون شيکر انکوباتور در دماي C°37 با دور 140 rpm قرار مي دهيم.
2. سلولهاي باکتريايي را با سرعت rpm10000 به مدت 3 دقيقه جمع آوري مي نماييم.
3. در اين مرحله رسوب باکتريايي را مي توان در دماي °C20- نگهداري نمود.
4. رسوب حاصله از مرحله 3 را در µl100 از محلول شماره 1 (پيوست 5) حل مي کنيم.
5. µl200 از محلول شماره 2 (پيوست 5) را به محلول حاصل از مرحله قبل اضافه کرده و به مدت 5 دقيقه درون يخ قرار مي دهيم.
6. µl150 استات سديم به محلول فوق اضافه کرده و به مدت 5 دقيقه درون ظرف يخ نگهداري مي نماييم.
7. محلول فوق را در rpm12000 به مدت 10 دقيقه سانتريفوژ مي نماييم.
8. با دقت مايع رويي را به تيوپ ديگري منتقل مي کنيم.
9. هم حجم مايع بدست آمده از مرحله قبل به آن مخلوط فنل، کلروفرم و ايزوآميل الکل به نسبت 25، 24، 1 اضافه مي کنيم.
10. محلول را در rpm12000 به مدت 10 دقيقه سانتريفوژ مي نماييم.
11. با دقت مايع رويي را به تيوپ ديگري منتقل مي کنيم.
12. به ميزان ml1 اتانول 96% سرد به مايع رويي اضافه کرده و به مدت 16 ساعت (ON) در °C20- نگهداري مي نماييم.
13. نمونه را در rpm12000 به مدت 10 دقيقه سانتريفوژ مي نماييم.
14. به ميزان µl750 اتانول 70% سرد به رسوب مرحله قبل اضافه کرده و مشابه با مرحله قبل سانتريفوژ مي نماييم.
15. رسوب بدست آمده را در µl30-20 آب ديونيزه استريل حل مي نماييم.
2-6-9 استخراج پلاسميد در مقياس زياد
براي اين کار از روش ليز قليايي استفاده شد. مراحل انجام اين روش به شرح زير مي باشد:
1. ميزان µl450 از محلول آنتي بيوتيکي تتراسايکلين (غلظت نهاييml / µg15) را به ml300 محيط کشت مايع LB اضافه نموده و سپس سلول E. coli TOP10F’ حاوي پلاسميد مورد نظر را به اين محيط تلقيح کرده و به مدت 16 ساعت (ON) بر روي شيکر انکوباتور C°37 قرار مي دهيم.
2. محيط كشت به لوله هاي 50 ميلي ليتري منتقل شده و با سرعت rpm10000 به مدت 4 دقيقه سانتريفوژ مي گردد.
3. پس از انجام سانتريفوژ، محيط کشت رويي تخليه شده و رسوب سلولي جمع آوري مي گردد. در اين مرحله مي توان رسوب سلولي را در دماي °C 20- نگهداري نمود.
4. رسوب حاصل از مرحله 3 را در ml6 از محلول شماره 1 (پيوست 5) حل مي کنيم.
5. به مقدار ml12 از محلول شماره 2 (پيوست 5) به تيوب فوق اضافه نموده و 10 دقيقه درون يخ قرار مي دهيم.
6. سي ميلي ليتر از محلول استات سديم M3 (2/5pH) به محلول فوق اضافه کرده و به مدت 30 دقيقه درون يخ نگهداري مي نماييم.
7. محلول را به مدت 15 دقيقه در rpm12000 در دماي 4 درجه سانتيگراد سانتريفوژ مي نماييم.
8. مايع رويي را از گاز استريل عبور داده و به محلول فيلتر شده، ml16 ايزوپروپانول اضافه نموده و به مدت 10 دقيقه در دماي اتاق نگهداري مي کنيم. سپس اين محلول را در دماي 4 درجه به مدت 10 دقيقه در rpm12000 سانتريفوژ نموده، مايع رويي را دور ريخته و رسوب حاصله را در دماي اتاق خشک مي کنيم.
9. رسوب خشک شده را در ml1 آب ديونيزه استريل حل کرده و به آن µl40 از محلول RNaseA (mg/ml10) اضافه کرده و به مدت 1 ساعت در دماي °C37 گرماگذاري مي نماييم.
10. به محلول فوق به نسبت 1:1 از فنل و کلروفرم اضافه نموده و به مدت 10 دقيقه در rpm12000 سانتريفوژ مي نماييم.
11. فاز رويي (فاز آبي) را به تيوپ جديد منتقل کرده و دو برابر حجم اين فاز، به آن اتانول 96% سرد اضافه نموده و به مدت 16 ساعت (ON) در °C 20- قرار داده و سپس به مدت 10 دقيقه در rpm12000 سانتريفوژمي نماييم.
12. مايع رويي را دور ريخته و به رسوب حاصل ml1 اتانول 70% سرد اضافه نموده و مجدداً سانتريفوژ مي نماييم.
13. مايع رويي را دور ريخته و رسوب حاصله را در دماي اتاق خشک نموده و سپس در µl150-100 آب ديونيزه حل مي کنيم.
2-6-10 الكتروفورز پروتئين بر روي ژل پلي اکريل آميد (SDS-PAGE)
مقدمه
الكتروفورز در واقع همان حركت ذرات باردار تحت تأثير ميدان الكتريكي، مي باشد. خصوصيات مولكول ها (اندازه، شكل، ميزان بار

Author: y7oozita

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *