منبع پایان نامه ارشد درمورد وکتور، آنزيمي، pHan-gcsf

pHan-gcsf
• بررسي کلون ها به روش سريع
مقداري از هر کلني بر اساس پروتوکل موجود (2-6-6) آماده سازي شده و بر روي ژل آگارز برده شد. وکتورهاي سنگين تر از وکتور بياني pHan (بدون ژن الحاقي)، به عنوان وکتورهاي مشکوک گزارش گرديد.
• استخراج پلاسميد در مقياس کم
از کلني هايي که gcsf PCR آنها مثبت گرديد، بر اساس پروتوکل2-6-8 به لوله هاي ml5 حاوي محيط LB مايع کشت داده و پس از گرماگذاري در °C37 به مدت 16 ساعت، استخراج پلاسميد در مقياس کم انجام گرديد.
• gcsf PCR بر روي پلاسميدهاي استخراج شده pHan-gcsf
پلاسميدهاي استخراج شده در واکنش PCR ژن gcsf بر اساس پروتوکل 2-7-1-1 وارد شده و محصول PCR بر روي ژل آگارز 1% برده شد.
• هضم آنزيمي وکتور تأييد شده pHan-gcsf
پلاسميد تأييد شده در مراحل قبل، مورد هضم آنزيمي با آنزيم هاي محدودالأثر BamHI، EcoRI و HpaI بر طبق جدول2-8 قرار گرفته و پس از گرماگذاري در C °37 به مدت 3 ساعت، محصول واکنشها بر روي ژل آگارز 1% برده شد.
مواد
مقدار (µl)
پلاسميد pHan-gcsf
2
بافر آنزيمي (10X)
2
آنزيم محدودالأثر (units/µl10)
75/0
آب ديونيزه
25/15
جدول 2-8 واکنش هضم آنزيمي وکتور pHan-gcsf
• استخراج پلاسميد نوترکيب pHan-gcsf در مقياس زياد
پلاسميد تأييد شده با تست هاي فوق، بر اساس پروتوکل هاي2-6-9 منظور استفاده در مراحل بعدي، به مقياس انبوه استخراج گرديد.
2-7-3 کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسين در وکتور بياني pHan-gcsf
2-7-3-1 PCR اختصاصي بر روي ژن مقاومت به زئوسين (Sh ble)
در اين تحقيق، به منظور غربالگري کلونهاي هانسونلا بر آن شديم تا ژن مقاومت به زئوسين (Sh ble) را در وکتور بياني pHan که حاوي ژن gcsf مي باشد کلون نماييم. براي اين منظور، توالي اين ژن در وکتور pPICZ? (Invitrogen, USA) موجود در بخش بيوتکنولوژي بررسي گرديد و پرايمرهاي لازم جهت تکثير اين ژن طراحي گرديد (جدول 2-9) و جهت سنتز سفارش داده شد. پس از دريافت پرايمرها، دماي بهينه براي تکثير اين ژن، به روش PCR گراديان، در محدوده 65-50 درجه سانتي گراد (جدول2-10) بر طبق جدول 2-11 انجام شد.
پرايمر F
5′-gtagatcttgcggatccccc-3′
پرايمر R
5′-gtagatcttggtctccagcttgc-3′
جدول 2-9 پرايمرهاي طراحي شده جهت تکثير ژن zeocin
تعداد چرخه
مدت زمان (دقيقه)
دما (°C)
واسرشتي اوليه
1
‘5
?94
واسرشتي
اتصال پرايمرها
طويل شدن
35
‘1
“30
“30
?94
60-50
?72
طويل شدن نهايي
1
‘5
?72
جدول 2-10 برنامه PCR گراديان ژن zeocin
مواد
مقدار (µl)
DNA الگو (پلاسميد pPICZ?) (1:10)
2
بافر PCR (X10)
2
کلريد منيزيم (mM25)
6/0
dNTPs (mM10)
4/0
پرايمر F (mM25)
3
پرايمر R (mM25)
3
Taq DNA polymerase (units/µl5)
1/0
آب مقطر
به حجم 20 ميکروليتر
جدول 2-11 مواد مورد نياز جهت انجام واکنش zeocin PCR
2-7-3-2 کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونينگ pGEM-T Easy
قطعه تکثير شده zeocin با استفاده از کيت از ژل آگارز بر اساس پروتوکل 2-6-2 استخراج شده و پس از تعيين غلظت،واکنش ليگاسيون آن در وکتور کلونينگ pGEM بر طبق جدول 2-12 صورت گرفت.
مقدار (µl)
مواد
واکنش اصلي
واکنش کنترل
وکتور pGEM-T Easy خطي (ng/µl50)
1
1
ژن zeocin (ng/µl50)
2

بافر T4 DNA ligase (X4)
5
5
T4 DNA ligase (units/µl5)
1
1
آب ديونيزه
11
13
جدول 2-12 واکنش ليگاسيون ژن zeocin در وکتور pGEM-T Easy
واکنشهاي فوق به صورت ON در دمايC ?4 قرار داده شدند و پس از تهيه سلولهاي مستعد از سلولهاي ‘ E. coli TOP10F ، به اين سلول ها منتقل شده و بر روي محيط LB آگار با غلظت پايين NaCl (پيوست 1) و حاوي زئوسين، تتراسايکلين، IPTG و X-gal (پيوست 5) کشت داده شد. پس از گرماگذاري در 37 درجه به مدت 16 ساعت، کلني هاي سفيد تشکيل شده، بر روي پليت ماتريکس حاوي ترکيبات فوق کشت داده شدند.
2-7-3-3 بررسي کلونهاي نوترکيب pGEM-Zeocin
• بررسي سريع کلونهاي نوترکيب
70% هر يک از کلني هاي سفيد به روش quick check (پروتوکل 2-6-6) مورد بررسي قرار گرفت.
• استخراج پلاسميد pGEM-Zeo در مقياس کم
از کلون نوترکيب تأييد شده با دو روش قبل، استخراج پلاسميد در مقياس کم (2-6-8) انجام گرديد.
• هضم آنزيمي وکتور pGEM-Zeo
هضم آنزيمي وکتور تأييد شده از مراحل قبل با آنزيم BglII به مدت 3 ساعت در دماي 37 درجه سانتي گراد بر اساس جدول 2-13 صورت گرفت.
مواد
مقدار (µl)
پلاسميد pGEM-Zeo
2
بافر آنزيمي (X10)
2
BglII (units/µl10)
5/0
آب ديونيزه
5/15
جدول 2-13 واکنش هضم آنزيمي pGEM-Zeo با BglII
2-7-4 کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسين در وکتور بياني pHan-gcsf
2-7-4-1 هضم آنزيمي وکتور pHan-gcsf و pGEM-zeo
براي کلون نمودن قطعه ژني مقاومت به زئوسين در وکتور pHan-gcsf، اين دو وکتور با آنزيم BglII که جايگاه برش آن در دو انتهاي قطعه ژني زئوسين و نيز بر روي وکتور pHan-gcsf در نظر گرفته شده بود، مورد هضم آنزيمي قرار گرفتند (جدول 2-14).
مواد
مقدار (µl)
پلاسميد
20
بافر آنزيمي (X10)
20
BglII (units/µl10)
5
آب ديونيزه
155
جدول 2-14 واکنش هضم آنزيمي pGEM-zeo و pHan-gcsf با BglII
وکتور pHan-gcsf هضم و تخليص شده، بر اساس جدول 2-15 به مدت 1 ساعت در 37 درجه سانتي گراد تحت تيمار با آلکالين فسفاتاز قرار گرفت.
مواد
مقدار (µl)
پلاسميد pHan-gcsf
60
بافر آنزيمي (X10)
8
آنزيم آلکالين فسفاتاز (units/µl10)
2
آب ديونيزه

جدول 2-15 تيمار وکتور هضم شده pHan-gcsf با آلکالين فسفاتاز
2-7-4-2 کلون نمودن قطعه ژني zeocin در وکتور بياني pHan-gcsf
پس از هضم آنزيمي، قطعه مورد نظر (ژن مقاومت به زئوسين، حدوداً bp1100( از روي ژل جدا شده و پس از تخليص با کيت، بر طبق واکنشهاي ليگاسيون جدول 2-16 در درون وکتور بياني pHan-gcsf تيمار شده با آلکالين فسفاتاز کلون گرديد.
مقدار (µl)
مواد
واکنش اصلي
واکنش کنترل
وکتور pHan-gcsf خطي شده (ng/µl100)
5/1
5/1
قطعه zeocin (ng/µl15)
25

بافر T4 DNA ligase (X2)
3
3
T4 DNA ligase (units/µl5)
1
1
آب ديونيزه

5/24
جدول 2-16 واکنش ليگاسيون ژن zeocin در وکتور بياني pHan-gcsf
واکنش‌هاي فوق به صورتON در دماي C?4 قرار داده شدند و روز بعد پس از تهيه سلولهاي مستعد از E. coli TOP10F’ به اين سلولها منتقل شده و بر روي پليت هاي LB آگار با غلظت پايين NaCl و حاوي زئوسين با غلظت µg/ml25 کشت داده شدند. پس از گذشت 16 ساعت در دماي C?37، از کلني هاي رشد يافته، پليت ماتريکس تهيه گرديد.
2-7-4-3 بررسي کلونهاي نوترکيب pHan-gcsf-zeocin
• بررسي سريع کلونهاي نوترکيب
کلونهاي رشد يافته بر روي پليت حاوي زئوسين به منظور بررسي الحاق قطعه ژني مقاومت به زئوسين بر روي ژل آگارز برده شدند.
• بررسي کلونها به روش Colony-PCR
کلونهايي که با روش سريع سنگينتر تشخيص داده شدند، براي انجام PCR اختصاصي ژن زئوسين مورد استفاده قرار گرفتند.
• برش آنزيمي وکتور نوترکيب pHan-gcsf-zeocin
به منظور تأييد نهايي وكتور نوترکيب فوق، با توجه به سايت‌هاي برشي موجود، وكتور بر اساس جدول 2-17 با آنزيم BglII برش داده شد. مخلوط اين واكنش به مدت 3 ساعت در دماي C?37 گرماگذاري شد و سپس بر روي ژل 1% برده شد.
مواد
مقدار (µl)
پلاسميد pHan-gcsf-zeocin
3
بافر آنزيمي (X10)
2
BglII (units/µl10)
5/0
آب ديونيزه
5/14
جدول 2-17 واکنش هضم آنزيمي pHan-gcsf-zeocin با BglII
2-7-5 انتقال پلاسميد نوترکيب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلي مورفا
2-7-5-1 هضم آنزيمي وکتور بياني pHan-gcsf-zeocin
پس از اطمينان از قرار گرفتن ژنهاي مورد نظر در پلاسميد هانسونلا، انتقال اين پلاسميد به درون ميزبان مخمري (هانسونلا پلي مورفا) با روش الکتروپوريشن صورت گرفت. براي اين منظور، به مولکول DNA خطي شده با غلظت بالا نياز مي باشد. براي تهيه DNA خطي، وکتور نوترکيب تأييد شده در مراحل قبل با آنزيم EcoRI بر طبق جدول 2-18 مورد هضم آنزيمي قرار گرفته و پس از استخراج از ژل، در پروسه الکتروپوريشن مورد استفاده قرار گرفت.
مواد
مقدار (µl)
پلاسميد pHan-gcsf-zeocin
15
بافر آنزيمي (X1)
20
EcoRI (units/µl10)
5
آب ديونيزه
160
جدول 2-18 واکنش هضم آنزيمي pHan-gcsf-zeocin با EcoRI
2-7-5-2 الکتروپوريشن سلول هاي هانسونلا پلي مورفا
1. ابتدا ميزان مناسبي از کلني تازه رشد يافته مخمر را به درون ml200 محيط کشت مايع YPD تلقيح نموده و محيط را بر روي شيکر در انکوباتور 37 درجه سانتي گراد گرماگذاري ميکنيم تا جذب نوري محيط در طول موج 600 نانومتر (OD600nm) به 2/1-8/0 برسد.
2. محيط کشت فوق را در rpm5000 به مدت 5 دقيقه سانتريفوژ نموده و به ميزان 2/0 برابر، بافر فسفات پتاسيم mM50 ولرم (C°37( با 5/7pH و سپس DTT 1مولار با غلظت نهايي mM25 به آن اضافه نماييد.
3. سلولها را به مدت 15 دقيقه در دماي C°37 قرار مي دهيم.
4. سلول ها را با سانتريفوژ در rpm5000 به مدت 5 دقيقه جمع آوري نموده و دو بار با بافر STM (پيوست 7) درحاليکه سلولها بر روي يخ قرار دارند شستشو مي دهيم (بار اول به صورت هم حجم و در مرحله دوم با نصف حجم اوليه).
5. رسوب سلولي نهايي را در 005/0 حجم اوليه از بافر STM حل کرده و اين سوسپانسيون سلولي مستعد را در حجم هاي کم در دماي C°70- نگهداري ميکنيم.
6. به منظور ترانسفورم نمودن سلولهاي مستعد، سوسپانسيون هاي سلولي (حجم µl60) را بر روي يخ ذوب نموده و µg10- ng200 از مولکول DNA خطي شده را به آن اضافه ميکنيم.
7. سپس سلولها به کووت الکتروپوريشن 2 ميلي متري سرد منتقل مي شوند.
8. بعد از خشک نمودن کووت آن را درون دستگاه الکتروپوريشن قرار داده و به آن پالسي با مشخصات 2 کيلوولت، 25 ميکروفاراد و 200 اهم وارد مينماييم.
9. بلافاصله پس از وارد نمودن پالس، ml1 محيط کشت YPD به تيوب حاوي سلولها اضافه کرده و به مدت 1ساعت در دماي °C 37 در شيکر انکوباتور قرار مي دهيم.
10. محيط را سانتريفوژ نموده (rpm5000, 5دقيقه( و سلولها را بر روي محيط کشت YPD جامد حاوي زئوسين با غلظت µg/ml400 کشت داده و به مدت 5-3 روز در دماي °C37 قرار ميدهيم.
11. سلولهاي رشد يافته در غلظت بالاي زئوسين (µg/ml400)، به صورت ماتريکس بر روي پليت حاوي 800 و سپس µg/ml1600 کشت داده شدند.
12. پس از گذشت مدت زمان لازم (3 روز) از کلونهاي رشد يافته براي انجام PCR اختصاصي ژنهاي کلون شده در وکتور بياني استفاده گرديد.
2-7-5-3 تأييد کلونهاي نوترکيب هانسونلا با روش Colony PCR اختصاصي ژن زئوسين
PCR اختصاصي ژن زئوسين بر روي کلونهاي نوترکيب رشد يافته در مراحل قبل بر اساس پروتوکل 2-7-3-1 و جدول 2-13 انجام گرديد.
2-7-6 بيان پروتئينGCSF در هانسونلا پلي مورفا
2-7-6-1 کشت سلولهاي مخمري
1. سلول مخمري تأييد شده با PCR ژن زئوسين و نيز سلول مخمري فاقد پلاسميد در ml5 محيط کشت BMGY (پيوست 1) کشت داده شده و بر روي شيکر در دماي ? °30 با دور rpm200 قرار داده شد تا

Author: y7oozita

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *