منبع پایان نامه ارشد درمورد وکتور، (mM25)، پروتئين

الكتريكي)، شرايط محيطي (قدرت يوني، pH، درجه حرارت و نوع ژل) و فاكتورهاي الكتريكي (اختلاف پتانسيل، شدت جريان و ولتاژ) ميتوانند در اين فرايند مؤثر باشند. از متداول ترين محيط هاي نيمه جامد براي الكتروفورز پروتئين ها پلي اكريل آميد مي باشد كه پروتئين ها را در محدوده وزني 500 تا 250000 دالتون از هم جدا مي كند. اين ماتريكس، پليمري از مولكول هاي خطي اکريل آميد و N و N- متيلن بيس اكريل آميد مي باشد. مولكول هاي بيس اكريل آميد پل هاي عرضي را بين مولكول هاي خطي اكريل آميد ايجاد مي كنند و تشكيل يك شبكه رشته اي را مي دهند كه قادرند پروتئين ها را از هم جدا كنند. پليمريزاسيون اين تركيبات در حضور آمونيوم پرسولفات آغاز مي شود و به دليل سرعت كم اين واكنش، از ماده TEMED بعنوان كاتاليزور واكنش پليمريزاسيون استفاده مي شود. عامل اصلي حركت مولكول هاي باردار در الكتروفورز، اختلاف پتانسيل (V) بين قطب هاي مثبت و منفي مي باشد. در روش SDS-PAGE پروتئين ها در حضور شوينده يوني SDS، الکتروفورز مي شوند. اين ماده به اسيد هاي آمينه هيدروفوب پروتئين ها متصل شده و ساختمان طبيعي پروتئين ها را واسرشته کرده و به ازاي طول زنجيره پپتيدي بار منفي ثابتي به آن ها اضافه مي کند. بنابر اين در اين نوع الکتروفورز، به دليل خنثي شدن اثر بار پروتئين ها توسط SDS، پروتئين ها تنها بر اساس اندازه و شکل از هم جدا مي شوند(Sambrook, 2001).
مواد لازم
– اكريل آميد
– N,N متيلن بيس اكريل آميد
– سديم دو دسيل سولفات (SDS)
– تريس بازي
– TEMED
– آمونيوم پرسولفات (APS)
– آب مقطر
– رنگ کوماس بلو (شامل كوماسي بريلينت بلو G250، متانول، اسيد استيك گلاسيال مي باشد)
– بافر نمونه x6 ( شامل تريس بازي، گليسرول، SDS، برومو فنل بلو و 2-مركاپتو اتانول (2-ME) مي باشد)
– بافر تانک X1 (شامل تريس، گلايسين،SDS و آب مقطر مي باشد، پيوست 6).
– الکل 96%
وسايل لازم
• سيستم الكتروفورز (منبع تغذيه، تانك، شيشه ها، فضا سازها و شانه )
• سرنگ هاميلتون
روش انجام كار
روش تهيه ژل تحتاني يا جدا كننده (پيوست 6)
• ژل تحتاني بر اساس جدول (3-1) تهيه مي شود. درصد ژل بستگي به وزن مولكولي پروتئين دارد. هر چه وزن مولكولي نمونه، بيشتر باشد از درصد پائين تر ژل استفاده مي شود تا پروتئين بهتر بتواند در ژل حرکت کند.
• محلول ها را تا قبل از اضافه نمودن TEMED اضافه نموده و خوب مخلوط نماييد.
2-6-10-1روش تهيه ژل فوقاني (پيوست 6)
• از اين ژل به منظور متراكم كردن نمونه پروتئيني استفاده مي شود و عموماً از ژل 4% استفاده مي شود. اين ژل بر اساس مقادير جدول(3-1) تهيه مي گردد.
• محلول ها را تا قبل از اضافه نمودن TEMED اضافه و به خوبي مخلوط نماييد.
• صفحات شيشه اي را با آب و الكل 70% كاملاً تميز کرده و دو فضا ساز بين صفحات شيشه اي قرار دهيد و با گيره محكم کنيد. در ظرفي جداگانه به 1 تا 2 ميلي ليتر از محلول ژل تحتاني کل TEMED لازم براي ژل تحتاني را اضافه کرده وتوسط آن سريعاً اطراف قالب شيشه اي و به ويژه انتهاي ژل را پوشانده تا از نشت احتمالي جلوگيري شود. قالب شيشه اي بطور عمودي روي سطح صاف قرار داده شود.
• پس از تهيه ژل تحتاني، TEMED را به آن اضافه كرده و پس از اينکه کاملاً مخلوط شد، داخل قالب شيشه اي تا ارتفاعي كه حدود 3 سانتيمتر فضا براي ژل فوقاني باقي بماند، بريزيد.
• سپس مقداري اتانول 96% را به گونه اي كه سطح ژل بهم نخورد، به آرامي در بالاي ژل ريخته و صبر کنيد تا ژل ببندد.
• پس از اطمينان از بسته شدن ژل تحتاني، الکل روي ژل را خالي و سطح ژل را چند بار با آب مقطر شستشو دهيد.
• شانه را بين دو شيشه در بالاي ژل قرار دهيد و سپس به ژل فوقاني تهيه شده، TEMED را اضافه نموده و پس از خوب مخلوط كردن بر روي ژل تحتاني بريزيد.
• پس از اطمينان از بسته شدن ژل فوقاني، شانه را به آرامي خارج و داخل چاهك ها را چندين بار با آب مقطر شستشو دهيد. قالب شيشه اي را با گيره به سيستم الكتروفورز وصل كرده و محفظه بالا و پائين سيستم را با بافر تانك پرکنيد.
جدول 2-1 نحوه تهيه درصدهاي مختلف ژل هاي فوقاني و تحتاني در SDS-PAGE
?
2-6-10-2 آماده سازي نمونه
• بر اساس نوع و غلظت نمونه، از بافر نمونه به آن اضافه كرده و به مدت 5 دقيقه در آب جوش قرار دهيد.
• نمونه ها را با استفاده از سرنگ هاميلتون در داخل چاهك ها بريزيد. مقدار نمونه قرار داده شده در هر چاهك بستگي به اندازه چاهك، ميزان خلوص نمونه، روش رنگ آميزي و نوع بافر نمونه (X2و X6) دارد.
• سيستم الكتروفورز را به منبع تغذيه وصل نماييد و در صورت استفاده از ولتاژ ثابت، هنگاميكه نمونه داخل ژل فوقاني است از ولتاژ V60 و بعد از ورود نمونه به داخل ژل تحتاني ولتاژ به V130 رسانده شود.
• پس از اتمام الكتروفورز (رسيدن رنگ نشانه به انتهاي ژل)، منبع تغذيه را خاموش کنيد. قالب شيشه اي را خارج كرده و فضا سازها بيرون آورده شود. با قرار دادن يكي از فضا سازها بين دو صفحه شيشه اي، شيشه بالايي را جدا نماييد.
• سپس ژل رنگ آميزي گردد.
2-6-10-3 رنگ آميزي ژل SDS-PAGE
به منظور مشاهده باندهاي پروتئيني، لازم است ژل را رنگ آميزي نمود. روشهاي مختلفي براي رنگ آميزي ژل هاي SDS-PAGE وجود دارد كه متداولترين آنها روش رنگ آميزي با كوماسي بلو و يا نيترات نقره مي باشد. عموماً از روش كوماسي بلو استفاده مي شود زيرا كه يك روش سريع و ارزان بوده و ثبات رنگ طولاني است.
استفاده از کوماسي بلو
مواد لازم
– رنگ كوماسي بلو
– الکل 96% (براي رنگ بري)
– آب مقطر
روش انجام رنگ آميزي
• ژل را در داخل ظرف رنگ آميزي قرار مي دهيم و مقداري رنگ به آن اضافه و به مدت10 دقيقه بر روي شيكر مي گذاريم.
• رنگ را خالي كرده و ژل را داخل محلول رنگ بر (آب مقطر حاوي اتانول) بر روي شيكر قرار مي دهيم تا زمينه ژل شفاف شده و باندهاي پروتئيني آبي رنگ نمايان شوند.
2-6-10-4 رنگ آميزي ژل به روش نيترات نقره (پيوست 7)
• قرار دادن ژل در بافر فيکساسيون به مدت 2 ساعت در دماي اتاق بر روي شيکر.
• دور ريختن بافر فيکساسيون و اضافه نمودن بافر شستشو سه بار و هر بار به مدت 20 دقيقه.
• اضافه کردن بافر sensitizing به مدت 2 دقيقه.
• دور ريختن بافر sensitizing و شستشو با آب مقطر سه بار و هر بار 5 دقيقه.
• اضافه کردن بافر رنگزا به مدت 20 دقيقه در دماي اتاق بر روي شيکر.
• شستشوي ژل در آب مقطر و اضافه کردن بافرdeveloping تا ظهور باندهاي پروتئيني.
• اضافه کردن بافر متوقف کننده به مدت 15 دقيقه.
• شستشوي ژل در آب مقطر.
2-7 روشهاي اختصاصي
2-7-1 سنتز ژن gcsf
توالي cDNA کد کننده پروتئين GCSF به طول bp 615 از بانک ژنومي (شماره 172219.1) استخراج و به منظور سنتز به يکي از شرکتهاي فعال در اين زمينه سفارش داده شد. اين توالي به منظور بيان در سلولهاي مخمري از نظر کدونهاي مورد استفاده در سنتز پروتئين، بهينه سازي شده و پس از بررسي هاي نهايي از نظر جايگاه هاي برش آنزيم هاي محدودالأثر، ساخته شده و در وکتور کلونينگ pGH کلون گرديد. در دو انتهاي اين ژن، دو جايگاه برش آنزيمي براي آنزيمهاي محدودالأثر HpaI و BamHI در نظر گرفته شد تا براي جدا نمودن اين قطعه و کلون کردن آن در وکتور بياني مخمر استفاده شوند. لازم به ذکر است که جايگاه برش اين آنزيم ها بر روي قطعه ژني سنتز شده، وکتور pGH و وکتور بياني هانسونلا وجود ندارد.
2-7-1-1 PCR اختصاصي بر روي ژن gcsf
2-7-1-1-1 طراحي پرايمرهاي اختصاصي ژن gcsf
به منظور انجام PCR بر روي ژن gcsf در وکتورهاي بدست آمده در مراحل مختلف، پرايمرهاي اختصاصي اين ژن با استفاده از برنامه genrunnr سنتز گرديد (جدول 2-2).
پرايمر F
‘gtagatcttgcggatccccc-3-‘5
پرايمر R
‘gtagatcttggtctccagcttgc-3-‘5
جدول 2-2: توالي پرايمرهاي ژن gcsf
2-7-1-1-2 بهينه ‌سازي واکنش PCR
با انجام گراديان PCR بهترين دماي اتصال پرايمرها به منظور بهينه سازي شرايط اين واکنش مشخص گرديد. اين واکنش بر اساس مواد ذکر شده در جدول2-3 و بر طبق برنامه مندرج در جدول 2-4 انجام شد.
مواد
مقدار (µl)
DNA الگو (وکتور pGH-gcsf) (1:10)
2
بافر PCR (X10)
2
کلريد منيزيم (mM25)
6/0
dNTPs (mM10)
4/0
پرايمر F (mM25)
3
پرايمر R (mM25)
3
Taq DNA polymerase (units/µl5)
1/0
آب مقطر
به حجم 20 ميکروليتر
جدول 2-3 مواد مورد نياز جهت انجام واکنش gcsf PCR
مواد
مقدار (µl)
DNA الگو (وکتور pGH-gcsf) (1:10)
2
بافر PCR (X10)
2
کلريد منيزيم (mM25)
6/0
dNTPs (mM10)
4/0
پرايمر F (mM25)
3
پرايمر R (mM25)
3
Taq DNA polymerase (units/µl5)
1/0
آب مقطر
به حجم 20 ميکروليتر
جدول 2-4 برنامه PCR گراديان مربوط به ژن gcsf
2-7-2 کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بياني هانسونلا
به منظور کلون نمودن قطعه ژني gcsf، اين قطعه با برش آنزيمي از وکتور کلونينگ حامل قطعه (pGH-gcsf) جدا شده و در وکتور بياني برش خورده با همان آنزيمها وارد گرديد.
2-7-2-1 هضم آنزيمي وکتور pGH-gcsf
با توجه به جايگاههاي برشي که در دو انتهاي اين قطعه (ژن gcsf) در نظر گرفته شد (جايگاه برش BamHI در انتهاي ´5 و جايگاه‌ برش HpaI در انتهاي ´?)، اين قطعه از وکتور مورد نظر (pGH-gcsf) بر اساس واکنش مندرج در جدول 2-5 در دماي 37 درجه سانتي گراد به مدت 5 ساعت مورد هضم آنزيمي قرار گرفت.
مواد
مقدار (µl)
DNA الگو (وکتور pGH-gcsf) (1:10)
2
بافر PCR (X10)
2
کلريد منيزيم (mM25)
6/0
dNTPs (mM10)
4/0
پرايمر F (mM25)
3
پرايمر R (mM25)
3
Taq DNA polymerase (units/µl5)
1/0
آب مقطر
به حجم 20 ميکروليتر
جدول 2-5 واکنش هضم آنزيمي وکتور pGH-gcsf
2-7-2-2 هضم آنزيمي وکتور بياني pHan
وکتور pHan نيز با آنزيمهاي BamHI و HpaI بر طبق جدول 2-6 مورد هضم آنزيمي قرار گرفت.
مواد
مقدار (µl)
DNA الگو (وکتور pGH-gcsf) (1:10)
2
بافر PCR (X10)
2
کلريد منيزيم (mM25)
6/0
dNTPs (mM10)
4/0
پرايمر F (mM25)
3
پرايمر R (mM25)
3
Taq DNA polymerase (units/µl5)
1/0
آب مقطر
به حجم 20 ميکروليتر
جدول 2-6 واکنش هضم آنزيمي وکتور pHan
2-7-2-3 کلون نمودن قطعه gcsf در وکتور بياني pHan
واكنش ليگاسيون قطعات هضم و تخليص شده پس از تعيين غلظت، بر طبق واکنش مندرج در جدول 2-7 انجام گرفت. تيوب ها به مدت 16 ساعت در يخچال قرار گرفته و پس از آماده سازي سلولهاي مستعد از E. coli TOP10F’، به اين سلولها منتقل شده و بر روي پليت هاي حاوي آمپي سيلين و تتراسايکلين کشت داده شدند.
مقدار (µl)
مواد
واکنش اصلي
واکنش کنترل
وکتور pHan خطي شده (ng/µl100)
1
1
قطعه gcsf (ng/µl15)
16

بافر T4 DNA ligase (10X)
2
2
T4 DNA ligase (units/µl5)
1
1
آب ديونيزه

17
جدول 2-7 واکنش ليگاسيون ژن gcsf در وکتور بياني pHan
کلني هاي ظاهر شده بر روي پليت ها، به صورت ماتريکس کشت داده شده و به مدت 16 ساعت در 37 درجه سانتي گراد گرماگذاري شدند.
2-7-2-4 بررسي کلون هاي نوترکيب

Author: y7oozita

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *