منبع پایان نامه ارشد درمورد پلي، هانسونلا، مورفا

موتانت هاي ايجاد شده بوسيله آن در مقايسه با موتانت هاي حاصل از مواد شيميايي متفاوت و گسترده تر مي باشد (Roggenkamp, 1986).
بطور کلي فرايندهاي جهش زايي متعددي در اين مخمر انجام شده است که يکي از اين فرايندها، جهش هاي ژنتيکي است که منجر به سنتز اسيدآمينه هاي آروماتيک مي شود که به مخمر اجازه رشد در محيط غني YPD را نمي دهند (Krappmann, 2000).
از جمله انواع جهش يافته هاي اکسوتروف ميتوان به موارد زير اشاره نمود:
1. سويه هانسونلا پلي مورفاي جهش يافته اي که براي رشد بر روي محيط هاي معدني الزاماً به ريبوفلاوين نياز دارد و محدود نمودن منبع ريبوفلاوين تأثير شديدي بر روي سنتز مجموعه الکل اکسيداز و تکثير پروکسي زومهاي سلولي دارد (Evers, 1994).
2. نوع دوم جهشهاي ايجاد شده در ژن FAD1 است که اسيد چرب دلتا2 را کد مي کند. کاربرد اين سلولهاي جهش يافته در بررسي ژنتيکي سنتز اسيدهاي چرب غيراشباع مي باشد ( (Anamnart, 1998.
تحقيقات اخير نشان داده است که هانسونلا پلي مورفا ميتواند براي بررسي مقاومت به فلزات سنگين مورد استفاده قرار گيرد چراکه توانايي رشد در حضور تجمع فلزات سنگين متفاوت را که براي ساير موجودات سمي است دارا مي باشد (Mannazzu, 1997).
در طي رشد در محيط حاوي vanadate، سلول ها افزايش قابل توجهي از پلي فسفات هاي واکوئلي پيدا ميکنند. احتمالاً نقش اين واکوئل ها در فعال کردن مکانيسم هاي اتوفاژي است که شايد براي جبران کمبود مواد مغذي و يا حذف ساختارهاي سلولي ناهنجار القاء شده توسط اين يون فلزي لازم باشند (Mannazzu, 1998).
سلول هاي هانسونلا پلي مورفا در مقايسه با S. cerevisiae به يون هاي کادميوم(cd2+) بسيار مقاومند )اين مقاومت به شدت به ماهيت منبع کربن استفاده شده بستگي دارد. سلول ها اغلب زمانيکه بر روي محيط حاوي گلوکز رشد ميکنند به کادميم مقاومتراند اما در طي رشد بر روي محيط حاوي متانول، به عنوان منبع کربن و انرژي، به اين يون بسيار حساس مي باشند. سويه هاي جهش يافته مقاوم به کادميوم به سه گروه cds1، cds2 و cds3 تقسيم ميشوند ( (Lahtchev, unpublished data.
جهش در ژنهاي کدکننده آنزيم هاي پراکسي زومي يا سيتوپلاسمي درگير در متابوليسم متانول
ژن AOX1 (MOX)، کدکننده آنزيم الکل اکسيداز (AO) موجود در ماتريکس پروکسي زوم است و يکي از بهترين ژن هاي هانسونلا پلي مورفا در تحقيقات مي باشد (Ledeboer, 1985). الکل اکسيداز يک آنزيم فلاووهومواکتامري است که اولين مرحله در متابوليسم متانول را کاتاليز ميکند. مونومر اين آنزيم در سيتوپلاسم سنتز شده و به صورت هومواکتامر فعال، تجمع يافته و در داخل پراکسي زوم قرار ميگيرد. حدود 210 نوع جهش يافته از ژن AO وجود دارد ( (Titorenko, 1995. بيان اين ژن در مرحله رونويسي تنظيم ميشود.
شکل 1-2 مورفولوژي سلولهاي H. polymorpha جهش يافته
در هانسونلا پلي مورفا وقايع مربوط به مهار و القاء ژنهاي کد کننده آنزيم هاي اختصاصي متانول و يا آنزيمهاي پراکسي زومي به شدت کنترل مي شوند. تنظيم در سطح رونويسي با مکانيسم هاي کنترلي قابل ملاحظه اي انجام ميشود. عناصر تنظيمي به فرم سيس3 در بالادست ژنهاي DAS، CAT4 و FMD5 با نقش مهاري براي گلوکز شناسايي شده اند.
1-3 نقشه ژنتيکي
آناليز تتراد در هانسونلا پلي مورفا امکان پذير است اما اندازه کوچک اسپورها روند اين آناليز را کند مي نمايد. در کشت سلول هاي ديپلوئيدي تفکيک مندلي نرمال در مورد بيشتر مارکرهاي ژنتيکي مشاهده شده است.
الکتروفورز DNA کروموزومي هانسونلا پلي مورفا به روش pulse field، 3 تا 7 باند را نشان داده است که به نوع سويه وابسته است (Mari, 1993)اما بطور کلي مشخص شده است که هانسونلا پلي مورفا حداقل 7 کروموزوم دارد که بعضي از آنها مضاعف (دو تايي) هستند (Naumov, 1992).
1-4 توليدمثل و اسپورزايي
فاکتورهايي در توليدمثل و اسپورزايي هانسونلا پلي مورفا درگيرند که هنوز بطور کامل شناسايي نشده اند. از القاء کننده هاي قوي توليدمثل جنسي ميتوان به مالتوز، گليسرول و سوربيتول اشاره کرد (Lahtchev, unpublished data).
سلول هاي هاپلوئيد بر اساس نوع فنوتيپشان به چهار گروه تقسيم ميشوند:
سويه هاي گروه 1 و 2 ميتوانند هيبريداسيون متقاطع6 داشته باشند. اين سويه ها سريع الرشد و تهاجمي بوده و پس از گذشت يک روز در محيط انتخابي، ديپلوئيدي مي شوند. سويه هاي گروه 3 توانايي جفتگيري با اعضاي گروه 1 و 2 را دارند و سويه هاي مثبت (+) نامگذاري مي شوند. سويه هاي گروه 4 تنها ميتوانند با گروه مثبت جفتگيري کنند و گروه منفي (-) را تشکيل دهند.
1-4-1 اسپورزايي
در هانسونلا پلي مورفا سلولهاي هاپلوئيدي توانايي اسپورزايي دارند. اسپورزايي هاپلوئيدها بعد از گذشت 8 روز در محيط حاوي 3% مالتوز در دماهاي پائين قابل تشخيص است. اسپورزايي با ظاهر شدن کلني هاي ديپلوئيدي به رنگ صورتي روشن همراه مي باشد.
در اواخر دهه 1960 کشف شد که مخمرها توانايي رشد بر روي محيط حاوي متانول به عنوان منبع کربن و انرژي را دارند (Ogata, 1969). اخيراً در تحقيقات پايه، متيلوتروف ها به عنوان منبع پروتئين هاي تک سلولي7 (SCP) ((Cooney and Levine, 1976) و آنزيم هاي غيرمعمول و متابوليت ها توجه بسياري را به خود جلب کرده اند. با استفاده از روشهاي جديد کلونينگ، ژن هاي کد کننده آنزيم هاي کليدي در متابوليسم متانول شناسايي شده اند (Wegner, 1990).
پروموترهاي MOX و FMD بعد از القاء، بسيار قوي عمل مي نمايند. اين مطلب با مشاهده ميزان بالاي بيان محصولات تحت تأثير اين پروموترها قابل انتظار است.
اين يافته ها استفاده از هانسونلا پلي مورفا، به عنوان يک ميزبان مناسب براي بيان به ميزان زياد ژنهاي هترولوگ با استفاده از اين پروموترها، به عنوان اجزاء کنترل کننده بيان، را قابل قبول نمايد (Roggenkamp, 1984; Hollenberg and Janowicz, 1988).
سيستم بياني شامل هانسونلا پلي مورفا سويه RB11 و پلاسميدهاي حاوي توالي هاي URA3و HARS18 است که به دنبال هم قرار گرفته اند. استفاده از پروموترهاي FMD يا MOX و ترميناتور MOX همراه با جايگاههاي برش آنزيمي کوتاه مربوط به کلونينگ9 (MSC) بين اين دو واحد، کلونينگ و بيان ORF10هاي هترولوگ را ممکن ساخته است.
آناليز سويه هاي بياني، پايداري ميتوزي قابل توجه پلاسميد هاي الحاق شده به درون ژنوم را نشان مي دهد که در بعضي موارد بيانگر سرعت بيان بالاي ORF هترولوگ مي باشد.
از طرف ديگر، سويه RB11، اغلب دستکاري هاي ژنتيکي به صورت نوترکيبي را به راحتي نمي پذيرد که شايد ناشي از پايداري ميتوزي فوق باشد. به نظر مي رسد سويه DL-1 نسبت به سويه RB11 توانايي پذيرش بيشتري را دارد (Gellissen, 1992).
1-6 پروموترهاي مورد استفاده در سيستم هاي بياني هانسونلا پلي مورفا RB11
يکي از پروموترهاي مورد استفاده براي توليد پروتئينهاي هترولوگ در هانسونلا پلي مورفا سويه RB11، پروموتر ژن MOX مي باشد که طول آن بيش از 5/1 کيلوباز بوده و در حضور منبع کربن تنظيم مي شود. به اين صورت که در حضور گلوکز، پروموتر MOX مهار مي شود ولي در حضور متانول، القاء مي گردد.
پروموتر ساير ژن هاي کدکننده آنزيم هاي کليدي در کاتابوليسم متانول از جمله FMD، DAS و CAT نيز مشابه با پروموتر ژن MOX کنترل مي شوند اما سطح تنظيمي بعضي از آنها همچون CAT مشخص نيست (Veenhuis, 1983).
اگرچه پروموترهاي FMD و MOX به طور واضحي مقايسه نشده اند اما بعضي مقايسه ها نشان داده است که مزاياي پروموتر FMD از پروموتر MOX بيشتر است. بعنوان مثال، هانسونلا پلي مورفا سويه RB11 بيان کننده ژن فيتاز تحت کنترل پروموتر FMD، بازده زيادي در تخمير در شرايط قحطي گلوکز دارد.
1-6-1 HARS1
پلاسميدهاي بياني مورد استفاده در هانسونلا پلي مورفا سويه RB11 داراي عنصر HARS1 به طول تقريبي 5/0 کيلوباز مي باشند. اين قطعه ژني در سالهاي اخير در طراحي وکتورهاي مناسب براي انتقال به هانسونلا پلي مورفا مورد توجه قرار گرفته است Roggenkamp, 1986)). پلاسميدهاي حامل توالي HARS1 در 30-20 نسل ابتدايي رشد سلولها به صورت اپي زومال باقي مي مانند اما پس از آن در ژنوم سلول مزبان به صورت تکرارهاي متوالي به تعداد زياد الحاق مي شوند. اين در حالي است که ناحيه اي که اين پلاسميدها دقيقاً در ژنوم ادغام مي شوند هنوز مشخص نيست Gellissen, 1990)). چهار عنصر ديگر از خانواده قطعه ژني HARS در سويه هاي DL-1 به دست آمده است اما تعداد کپي آنها از تعداد عناصر HARS1 در سويه RB11 کمتر است.
جزئيات مکانيسم ادغام شدن پلاسميدهاي حاوي توالي HARS1 در ژنوم اين مخمر هنوز مشخص نيست. تنها ويژگي شناخته شده، توانايي ادغام شدن به صورت تواليي تکراري و غيرتصادفي است که قسمت خاصي از ژنوم را انتخاب مي کند (Sohn, 1996).
شکل 1-3 تصوير پلاسميد بياني مخمر H. polymorpha
1-7 بيان همزمان11:
با چنين سيستم هايي، مجموعه هاي پروتئيني هترومري توليد مي شود. يک مثال قابل توجه از اين نوع بيان، بيان همزمان آنتي ژن هاي S و Lويروس هپاتيت B است.
از ديگر موارد بيان همزمان ميتوان به بيان ژن هاي کد کننده گليکولات اکسيداز (GO) اسفناج و کاتالاز (CTT1) T ساکاروميسس سرويزيه در هانسونلا پلي مورفا اشاره نمود.
بيان، پردازش، تغيير و تبديل و يا ترشح مؤثر پروتئينهاي نوترکيب خاص در هانسونلا پلي مورفا ممکن است دچار تغيير شود. اين محدوديت مي تواند با بيان همزمان ژن مورد نظر با يک ژن دوم (يا بيش از يک ژن ديگر) برطرف شود به همراه مي آورد. به عنوان مثال فرآيند پردازش نادرست اينترفرون آلفا 2a، مي تواند با بيان همزمان ژن KEX2 ساکاروميسس سرويزيه بهبود يابد.
1-8 ترشح پروتئين هاي هترولوگ اليگومري و فعال
هانسونلا پلي مورفا مقدار کمي پروتئين دروني (خودي) ترشح مي کند و در نتيجه اين ويژگي، پروتئين هاي هترولوگ ترشح شده به محيط کشت، عموماً خالص هستند. بنابراين استفاده از اين ميزبان بياني، روش مناسبي جهت توليد پروتئين هاي نوترکيب خارجي به فرم محلول مي باشد. ترشح پروتئين ها توسط تواليهاي نشانه (سيگنال) قابل جداسازي انجام مي شود. اگرچه گاهاً مستقل از سيگنال ترشحي، در مواردي ترشح خودبخودي پروتئين هترولوگ نيز مشاهده شده است (Gellissen, 2000).
براي درک توانايي هانسونلا پلي مورفا در توليد و ترشح پروتئين هاي هترولوگ، سويه هايي از اين مخمر به منظور ترشح الکل اکسيداز (AOX) مهندسي گرديدند. الکل اکسيداز، يک پروتئين هومواکتامر کوفاکتوري است که هر زيرواحد آن داراي يک مولکول FAD12 مي باشد (van der Klei et al, 1991). زمانيکه هانسونلا پلي مورفا بر روي محيط حاوي متانول رشد مي کند فعاليت پروتئين AOX در ماتريکس پراکسي زومي، جائيکه اکثر پروتئين هاي اصلي وجود دارند، محدود مي شود.
از طرف ديگر، براي فهم چگونگي ترشح الکل اکسيداز، سويه هايي از هانسونلا پلي مورفا مهندسي گرديد که ژن اندوژن AOX با ژن AOX به دنبال سيگنال ترشحي در انتهاي N، جايگزين شد. به دنبال کشت اين سويه در محيط کشت حاوي متانول، حضور AOX فعال شناسايي گرديد که اين بيان نشان مي دهد هانسونلا پلي مورفا قادر به توليد و ترشح کمپلکسهاي پروتئيني داراي کوفاکتور و ساختارهاي اليگومري مي باشد (van der Heide and Veenhuis, Unpublished results).
1-9 توليد واکسن نوترکيب
در بسياري از کشورها واکسن هاي عليه هپاتيت در اوايل دهه 1980 در دسترس عموم قرار گرفت. اين واکسن ها با جداسازي آنتي ژن HBs13 از سرم افراد ناقل توليد شده بود که اگرچه مؤثر بودند اما به دليل مشتق شدن از سرم، گران بوده و مدت زمان کوتاهي به سيستم ايمني عرض

Author: y7oozita

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *