پایان نامه ها و مقالات

منبع پایان نامه با موضوع گروه کنترل، نفوذپذیری

دی ۸, ۱۳۹۷

ش بسیار مهمی دارند. استفاده از این مواد در محیطهای ذوب و بنابراین حضورشان در فضای خارج سلولی، از ورود ناگهانی آب به داخل سلول و ایجاد شوک اسمزی جلوگیری میکند (Schneider and Mazur, 1984). بنابراین برای افزایش بازده فرایند انجماد-ذوب، باید ترکیبی از هر دو گروه ضدیخ استفاده شود.

از ضدیخهای نفوذناپذیر میتوان به ساکاریدهایی همچون ساکارز70، ترهالوز71 و ماکروملکولهایی مانند پلی وینیل الکل72 و پلی وینیل پیرولیدون73 اشاره کرد. اتیلنگلیکول74، گلیسرول75 و دی متیل سولفوکسید76 نیز، از جمله ضدیخهای نفوذپذیر پرکاربرد هستند (Fasano, 2013). از آنجایی که برخی ضدیخها برای سلول سمی هستند و نمیتوان غلظتهای بالایی از آنها را مورد استفاده قرار داد، بهتر است از ترکیب چند ضدیخ با غلظت پایینتر استفاده نمود. به این ترتیب میتوان تاثیرات سمی غلظتهای بالای هریک از آنها را کاهش داد. به این عمل، خنثیسازی سمیت مواد سرما محافظ77 میگویند (Tucker and Liebermann, 2007). علاوه بر این مشاهده شده است که نفوذ پذیری ترکیبی از چند ضدیخ، نسبت به نفوذپذیری هریک از آنها به تنهایی، به طور معنی داری بالاتر است (Vicente and Garcia-Ximenez, 1994).

1-2-3-3 روشهای انجماد
جهت حفظ و ذخیرهی سلول و رویان، دو روش انجماد آهسته78 و انجماد شیشهای79، مورد استفاده قرار میگیرند. این دو روش از نظر نحوهی ذخیره، ذوب و آبدهی تا حدودی مشابه ولی از نظر غلظت ضدیخهای مورد استفاده و مرحلهی انجماد کاملا متفاوت میباشند (Karlsson, 2002).

1-2-3-3-1 انجماد آهسته
اساس این روش، کاهش دما به صورت آهسته و کنترل شده تا اC 196- میباشد که به این منظور از یک دستگاه فریزر قابل برنامهریزی80 استفاده میشود. در انجماد آهسته، نمونه پس از متعادلسازی در محیطی با غلظت پایین مواد سرما محافظ، درون نی پلاستیکی مخصوص قرار گرفته و طی چند مرحله سرد میشود.
سرعت سرد شدن نمونه طی این فرایند، ابتدا سC/min 2- و در ادامه C/min 3/0- تا 6/0- میباشد. با رسیدن دما به محدودهی یC 30- تا 60-، نی حاوی نمونه درون ازت مایع برده شده و نگهداری میشود (Cutting et al., 2009).
انجماد آهسته برای اولین بار در سال 1972 بر روی رویان موش انجام گرفت و نوزاد حاصل از انتقال مرولای منجمد-ذوب شده متولد گردید (Whittingham et al., 1972). مطالعات بعدی، منجر به بهبود و توسعهی این تکنیک و ورود آن به حوزهی انسانی شد. به طوریکه در سال 1983، اولین بارداری موفقیت آمیز در مورد انتقال رویان انسانی منجمد-ذوب شده اعلام گردید (Trounson and Mohr, 1983). علیرغم پیشرفتهایی که در انجماد آهسته صورت گرفته است، امروزه این روش در زمینهی انجماد سلول و رویان کاربرد زیادی ندارد. زیرا انجماد آهسته، علاوه بر این که روشی زمانبر و گران قیمت است، برای انواع سلولها و رویانها نیز مناسب نمیباشد. همچنین با وجود این که نمونه با سرعت کمی از ناحیهی خطر عبور کرده و مجال جابجایی محلول، بین محیط خارج و داخل سلول مهیا است و شوک اسمزی شدیدی رخ نمیدهد، به نظر میرسد غلظت پایین مواد سرما محافظ مورد استفاده، برای ممانعت از تشکیل کریستال یخ کافی نیست. این امر در نهایت منجر به آسیب سلولی خواهد شد (Vajta and Kuwayama, 2006). بنابراین برای برطرف کردن نواقص این روش، انجماد شیشهای بر پایهی دو اصل، غلظت زیاد مواد سرما محافظ و سرعت بالای سرمادهی81 و گرمادهی82 روی کار آمد.
1-2-3-3-2 انجماد شیشهای
انجماد شیشهای، به معنی انجماد محلول، بدون تشکیل کریستال یخ (شکل ‏113) در دمای پایین میباشد، که این امر با افزایش غلظت مواد سرما محافظ و نرخ سرمادهی بالا امکان پذیر است. به طور خلاصه، در این روش ابتدا رویانها در یک محلول حاوی عوامل سرما محافظ با غلظت پایین قرار میگیرند که منجر به از دست دادن آب و نفوذ ضدیخ به درون سلولها میشود، در مرحلهی بعد رویانها به مدت خیلی کوتاه (حدود یک دقیقه) درون غلظت بالاتری از ضدیخ قرار گرفته و در ادامه توسط حاملهای انجماد، به درون ازت مایع منتقل میشوند. بنابراین در این روش، نمونه با سرعت زیادی ( C/min 30000-15000) از ناحیهی خطر عبور کرده و به یکباره تا دمای C 196- سرد میشود. فرایند ذوب نیز با سرعت و به کمک رقیقسازی محلولهای حاوی ساکارز انجام میگیرد (Mukaida and Oka, 2012).

شکل ‏113: فرایند شیشهای شدن محیط انجماد در حضور مواد سرما محافظ طی انجماد شیشهای (Liebermann et al., 2003).

در این نوع انجماد، مدت زمان انجام فرایند کم است و نیازی به تجهیزات پیچیده و گران قیمت نمیباشد. همچنین، با استفاده از غلظتهای بالای مواد سرما محافظ، آسیبهای ناشی از کریستال یخ، کاهش یافته است. برای مقابله با اثرات سمی ضدیخ نیز، علاوه بر استفاده از ترکیب چند نوع مادهی سرما محافظ با غلظتی مناسب، نمونه مدت زمان کمتری در مجاورت با این عوامل قرار میگیرد (Vajta and Kuwayama, 2006). با توجه به این مزیتها، تکنیک انجماد شیشهای که برای اولین بار، در سال 1937 توسط Luyet و همکارانش مطرح گردید (Luyet, 1937)، به تدریج در زمینهی حفظ رویانهای حیوانی و انسانی جایگزین انجماد آهسته شد.
چند سال پس از مطرح شدن ایدهی انجماد شیشهای، این روش با موفقیت بر روی رویان 4 سلولی موش انجام شد و نرخ زندهمانی بهتری نسبت به انجماد آهسته بدست آمد (Rall and Fahy, 1985). در ادامهی این روند تکاملی، گزارشی مبنی بر انجماد رویان 8 سلولی موش توسط Rall و همکارانش منتشر گردید (Rall et al., 1987) و سرانجام در سال 2000 اولین حاملگی و تولد بعد از انتقال بلاستوسیست انسانی منجمد-ذوب شده به این روش و با استفاده از دی متیل سولفوکسید و اتیلنگلیکول گزار
ش
شد (Yokota et al., 2000).

با در نظر گرفتن مزایای ذکر شده در بخش 1-2-2، در مورد برتری انتقال بلاستوسیست نسبت به سایر مراحل رویان، انجماد موفقیت آمیز رویان در این مرحله، بسیار حائز اهمیت میشود. با توجه به کوچک شدن اندازهی بلاستومرها و کاهش میزان آب درون سلولی طی فرایند تسهیم، انتظار میرفت میزان زندهمانی بلاستوسیستهای ذوب شده بیشتر از مراحل قبلی باشد. اما نتایج نشان دهندهی نرخ زندهمانی پایینتر بلاستوسیست ذوب شده بود. دلیل این مسئله را میتوان در حفرهی پر از مایع بلاستوسل جستجو کرد. وجود این حفره، علاوه بر این که شرایط بهتری را برای تشکیل کریستالهای یخ و در نتیجه صدمه به ساختار سلولی فراهم میآورد، مانعی برای رسیدن مواد سرما محافظ به سلولهای درونی رویان نیز میباشد. برای حل این مشکل، میتوان غلظت مواد سرما محافظ یا زمان مجاورسازی رویان با این مواد را افزایش داد. اما از آنجایی که هر دو رویکرد بر روی سلامت رویان تاثیر منفی دارد تکنیک جدیدی به نام سوراخ کردن مصنوعی83 به منظور کاهش حجم مایع بلاستوسل، روی کار آمد (Desai et al., 2008, Vanderzwalmen et al., 2002)

1-2-4 سوراخ کردن مصنوعی
برای کاهش حجم مایع درون حفرهی بلاستوسل، قبل از انجماد شیشهای، میتوان از روش سوراخ کردن مصنوعی که یکی از تکنیکهای ریز دستکاری84 رویان است، استفاده نمود. این تکنیک میتواند به وسیلهی لیزر و یا توسط روشهای مکانیکی مانند پیپت کردن مکرر رویان و همچنین سوراخ کردن بلاستوسیست با ریز سوزنهای شیشهای85 صورت پذیرد (شکل ‏114) (Desai et al., 2008, Kader et al., 2009).
در سال 2002، Vanderswalmen و همکارانش با سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست انسانی، به وسیلهی ریز سوزن شیشهای، قبل از انجماد، افزایش نرخ زندهمانی (6/70% در مقابل 3/20%) و لانهگزینی (12% در مقابل 4/1%) را نسبت به عدم استفاده از این تکنیک مشاهده کردند (Vanderzwalmen et al., 2002). در سال 2008 نیز، Desai و همکارانش تاثیر سوراخ کردن مصنوعی بلاستوسیست را قبل از انجماد شیشهای به وسیلهی دو روش لیزر و مکانیکی بررسی کردند. در این آزمایش نرخ زندهمانی، حتی در رویانهایی که فقط تحت فرایند انجماد قرار گرفته بودند (گروه کنترل) نیز بالا بود و اختلاف معنیداری با دو گروه دیگر نداشت.
اما استفاده از این تکنیک (توسط هر دو روش)، میزان آسیب به DNA را کاهش و میزان بازگشت به حالت اولیه86 را نسبت به گروه کنترل افزایش داده بود (Desai et al., 2008). بنابراین اگرچه امروزه با بهبود روش انجماد شیشهای، نرخ زندهمانی بلاستوسیستها حتی بدون استفاده از این تکنیک نیز بالا میباشد، اما سایر مزایای آن از جمله افزایش نرخ لانهگزینی و کاهش میزان آسیبهای وارد شده به DNA، موجب حفظ جایگاه این روش در تکنیکهای کمک باروری شده است.
تا کنون مطالعهای در مورد تاثیر کاهش مایع بلاستوسل بر روی بیان ژنهای دخیل در تکوین اولیهی رویان صورت نگرفته است. از آنجایی که حضور مایع بلاستوسل برای شکلگیری ردهی اندودرم اولیه الزامی است (بخش 1-1-3-2)، ما در این طرح در نظر داریم تاثیر کاهش مایع بلاستوسل قبل از انجماد شیشهای را بر روی بیان ژنهای Gata6 و Grb2 بررسی کنیم. علاوه بر این نرخ زندهمانی و خروج از زونای بلاستوسیستها نیز، در صورت استفاده و عدم استفاده از این تکنیک مورد ارزیابی قرار خواهد گرفت.

شکل ‏114: روشهای مختلف سوراخ کردن مصنوعی حفرهی بلاستوسل. الف: توسط ریز سوزنهای شیشهای ب: توسط لیزر ج: مکش مایع حفرهی بلاستوسل با ایجاد فشار منفی د: پیپت کردن مکرر رویان (Kader et al., 2009).

2 مواد و روشها
تمامی مراحل مطالعاتی و آزمایشگاهی این طرح، در پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیستفناوری87 انجام شد.

2-1 حیوان
در این مطالعه از موشهای نژاد NMRI88استفاده گردید. این موشها در اتاق حیوانات و درون قفسهایی مجهز به سیستم تهویهی مجزا89، تحت شرایط 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی، در دمای C 23-18 و رطوبت 70-40% نگهداری شدند (شکل ‏21). میزان آب و غذای روزانهی استفاده شده به ازای هر gr 10 وزن موش، ml5/1 آب و gr 5/1 غذای جوندگان بود.

شکل ‏21: قفسهای دارای سیستم تهویهی مجزا

2-2 تولید رویان آزمایشگاهی90
2-2-1 استحصال اسپرم
برای استحصال اسپرم از موشهای نر با سن 12-10 هفته، که حداقل از سه روز قبل جفتگیری نکرده بودند استفاده گردید.

2-2-1-1 آمادهسازی محیط و قطرهها
در این مرحله، از محیط HTF (Quinn et al., 1985) به همراه mg/ml 3/36 سدیم پیروات91 (P5280, Sigma) و mg/ml 6 آلبومین سرم گاوی92 (A6003, Sigma) و mg/ml 7/30 گلوتاتیون93 (G4251, Sigma) استفاده شد (پیوست الف-1). از این محیط، دو قطره با حجم تقریبی l 300، در یک نیمه پتری دیش94 mm60×15 (150288,Nunc,Denmark) گذاشته و روی آنها با روغن معدنی95 استریل ((M5310, Sigma پوشیده شد (شکل ‏22). سپس پتری دیش حداقل به مدت 4 ساعت درون انکوباتور96 (Memmert, Germany) با دمای بC 37، رطوبت 97% وCO2 به میزان 5% قرار گرفت.

شکل ‏22: پتری دیش استحصال اسپرم

2-2-1-2 جابجایی مهرهی گردنی97
موش بر روی قفس قرار گرفت. حرکت آن، با قرار دادن انگشت شست و اشاره بر قاعده جمجمهاش مهار گردید و برای جابجایی مهرههای گردنی، دم آن به سمت عقب کشیده شد (شکل ‏23).

شکل ‏23: جابجایی مهرههای گردنی

2-2-1-3 تشریح موش نر و جداسازی اپیدیدیم98
موش کشته شده، به پشت خوابانده و سطح شکمی آن الکل 70% زده شد. سپس طی دو مرحله، پوست و لایهی صفاقی99 آن به صورت عرضی برش خورد (شکل ‏24 الف، ب)، به طوری که حفرهی
شکمی کاملا نمایان گشت (شکل ‏24 ج). به واسطهی کشیدن تودهی چربی100 واقع در بالای بیضه101، به سمت بالا و خارج از حفرهی شکمی، موقعیت دمِ اپیدیدیم102 و لولهی اسپرمبر103 نیز مشخص شد (شکل ‏24 د).

در این حالت چربیها و پردهی مزومتریوم104 اطراف این مجموعه حذف و دمِ اپیدیدیم به همراه لولهی اسپرمبر جدا گشت و درون روغن معدنی استریل، مقابل قطرههای موجود در پتری دیش استحصال اسپرم منتقل شد.

شکل ‏24: تشریح موش نر الف: ایجاد برش در پوست ب: ایجاد برش در لایهی صفاقی ج: موقعیت بیضهها در حفرهی شکمی (فلشهای سیاه) د: 1- تودهی چربی 2- بیضه 3- دم اپیدیدیم 4- لولهی اسپرمبر، محل برشها با خطوط سیاه نشان داده شده.

2-2-1-4 جمعآوری و ظرفیتپذیری اسپرم105
در زیر استرئومیکروسکوپ106 (Nikon, SMZ 1000, Japan) و بر روی صفحهی گرم کننده107 با دمای ا C37، به کمک دو پنس استریل و فشار بر روی دمِ اپیدیدیم و لولهی اسپرمبر که درون پتری دیش قرار گرفتهاند، تودهی اسپرم به خارج از لوله هدایت و به درون قطرهی HTF منتقل شد (شکل ‏25). پتری دیش به منظور ظرفیتپذیر شدن اسپرمها به مدت یک ساعت در انکوباتور با دمای C37، رطوبت 97% و CO2 به میزان 5% نگهداری شد.

سپس اسپرمهای زنده و متحرک حاشیهی قطره، به کمک پیپت پاستور108 جمعآوری (شکل ‏26)، به میکروتیوب1091l 250 منتقل و تا زمان لقاح، درون انکوباتور با دمای C37، رطوبت 97% و CO2 به میزان 5% نگهداری شدند.

شکل ‏25: جمعآوری اسپرم الف: دمِ اپیدیدیم و لولهی اسپرم بر درون پتری دیش استحصال اسپرم ب: هدایت تودهی اسپرم به خارج از لولهی اسپرمبر (بزرگنمایی 8×) ج: انتقال تودهی اسپرم به قطرهی محیط کشت د: تودهی اسپرم منتقل شده به درون محیط کشت (بزرگنمایی 10×)

شکل ‏26: نحوهی جمعآوری اسپرمهای زنده از حاشیهی قطرهی محیط کشت

2-2-2 استحصال تخمک
برای استحصال تخمک، از موشهای ماده با سن 8-7 هفته استفاده گردید.

2-2-2-1 تحریک تخمکگذاری110
موشهای ماده، تحت تزریق 8 واحد بینالمللی111هورمون گنادوتروپین سرم مادیان آبستن112 (Gonaser®, Laboratorios Hipra) و 48 ساعت بعد، همین مقدار هورمون گنادوتروپین جفتی انسان113 (111, Pregnyl® Darou pakhsh) قرار گرفتند. ترزیق بهصورت داخل صفاقی114 انجام شد.

2-2-2-1-1 تزریق داخل صفاقی
موش بر روی قفس قرار گرفت، دم آن توسط یک دست گرفته و کمی به سمت عقب کشیده شد. حرکت موش با گرفتن پوست پشت گردن و گوشهای آن توسط انگشتهای شست و اشاره و گذاشتن دم آن زیر انگشت کوچک مهار گردید. سپس، برگردانده شد و تزریق توسط سرنگ انسولین ( 0197, KPH) در یک چهارم پایینی شکم موش انجام گرفت (شکل ‏27).

شکل ‏27: نحوهی ترزیق داخل صفاقی موش

2-2-2-2 آمادهسازی محیط و قطرهها
در استحصال تخمک از محیط M2115 (Quinn et al., 1982) که به آن mg/ml3/36 سدیم پیروات و mg/ml 4 آلبومین سرم گاوی اضافه شده بود استفاده گردید (پیوست الف-2).

No Comments

Leave a Reply