پایان نامه ها و مقالات

پایان نامه با کلید واژگان مورفولوژی، انعطاف پذیری، نرخ باروری، شیمی درمانی

دی ۸, ۱۳۹۷

تروفواکتودرم در موش. اتصالات سلولی بلاستومرهای داخلی، موجب راه اندازی مسیر پیام رسان Hipoo، غیرفعال شدن Tead4 و بنابراین سرکوب Cdx2 میشود. در سلولهای خارجی، غیرفعال ماندن این مسیر، رونویسی از ژن Cdx2 را در پی دارد (Cockburn and Rossant, 2010).
1-1-3-2 جدایی دو ردهی سلولی اپیبلاست و اندودرم اولیه
جدایی این دو ردهی سلولی، بیش از آنکه با موقعیت سلولها در ارتباط باشد، به بیان عوامل رونویسی وابسته است. بهطور کلی، وقایع این دوره را میتوان در سه مرحله خلاصه کرد (شکل ‏111). ابتدا، عوامل رونویسی اختصاصی دو رده، به شکل یکنواخت و همراه با هم در توده سلولی داخلی بیان میشوند (پیرامون مرحلهی 32 سلولی). در ادامه، این دو گروه عامل رونویسی، بصورت ناسازگار با هم و مستقل از موقعیت سلول، در تودهی داخلی توزیع میگردند. به این الگوی توزیع، اصطلاحا “نمک و فلفل45” گفته میشود (پیرامون مرحلهی 64 سلولی). نهایتا، با حرکت سلولها به موقعیت مناسب خود، جدایی فضایی ومکانی دو رده نیز رخ میدهد (پیرامون مرحلهی 100 سلولی) (Xenopoulos et al., 2012).

شکل ‏111: جدایی دو رده سلولی اندودرم اولیه و اپیبلاست در سه مرحله (Xenopoulos et al., 2012).

یکی از مسیرهای انتقال پیام دخیل در این ردهزایی، مسیر FGF46/MAPK است که فعال شدن آن موجب القای بیان عوامل رونویسی اختصاصی اندودرم اولیه، مانند 47Gata6 میشود. Gata6 مانند 5 عضو دیگر خانوادهی GATA، دارای موتیف انگشت روی48 و همچنین قدرت اتصال به توالی (A/G) GATA (A/T) است.
گیرندهی این مسیر Fgfr2، لیگاند آن Fgf4 و پروتئین تطبیق دهندهی آن، Grb249 است. در مقابل، عوامل پرتوانی قرار گرفتهاند که سلولهای تودهی داخلی را به سمت اپیبلاست سوق میدهند و موجب حفظ خاصیت پرتوانی این سلولها میشوند. یکی از این عوامل رونویسی Nanog است که در مرحلهی 64 سلولی، بیان آن با Gata6 ناسازگار میشود. بنابراین سلولهایی که مسیر انتقال پیام FGF/MAPK در آنها فعال باشد، با بیان Gata6 و مهار Nanog به سمت اندودرم اولیه متمایز میشوند و بالعکس، سلولهایی با مسیر انتقال پیام غیرفعال، ردهی اپیبلاست را تشکیل میدهند (شکل ‏112). جهش در ژن Grb2 موجب اختلال در مسیر FGF/MAPK و عدم شکلگیری اندودرم اولیه میشود. اما در مورد رویانهایی که از نظر Gata6جهش یافتهاند، اندودرم اولیه شروع به شکلگیری میکند ولی بعد از لانهگزینی، اندودرم احشایی50 ایجاد نمیشود (Chazaud et al., 2006, Patient and McGhee, 2002).
قابل ذکر است که پس از مشخص شدن سرنوشت بلاستومرها توسط تنظیمات مولکولی، بازیابی مکانی این دو گروه سلول، تحت اثر نوع اتصالات و همچنین پیامهایی که از طرف حفرهی بلاستوسل و سلولهای تروفواکتودرم فرستاده میشوند، انجام میپذیرد. سلول پیشساز اندودرم اولیهای که در عمق قرار گرفته است اگر موفق به جابجایی نشود، توسط مرگ برنامهریزی شده از بین میرود و یا اینکه به سلول پرتوان اپیبلاست تبدیل میشود (Oron and Ivanova, 2012).

شکل ‏112: دخالت مسیر پیام رسان FGF/MAPK در جدایی دو ردهی اندودرم اولیه و اپیبلاست. بازیابی مکانی این دو رده در روز 5/4 کامل میشود (Chazaud et al., 2006).
1-2 تکنیکهای کمک باروری
یکی از ویژگیهای رویان در مراحل قبل از لانهگزینی، توانایی تکوین آن در محیطهای کشت ساخته شده توسط بشر است. این انعطاف پذیری، در توسعه تکنیکهای کمک باروری که امروزه به دلیل افزایش ناباروری از اهمیت قابل توجهی برخوردار هستند، کمک شایانی کرده است (Cockburn and Rossant, 2010).

1-2-1 لقاح آزمایشگاهی51
لقاح آزمایشگاهی، یکی از تکنیکهای کمک باروری است، که به دلایل مختلفی همچون انسداد لولههای رحم، تعداد کم اسپرم و چسبندگیهای حفرهی لگنی مورد استفاده قرار میگیرد (Squires and Kaplan, 2007). تا کنون این تکنیک، در بیش از 20 گونه از پستانداران صورت گرفته است. اولین بارداری موفق که منجر به تولد یک پستاندار زنده شد، توسط Chang در سال 1959 و بر روی خرگوش صورت پذیرفت (Chang, 1959). در سال 1968 نیز، برای نخستین بار رویانهای موش حاصل از لقاح آزمایشگاهی متولد شدند (Whittingham, 1968). سرانجام اولین نوزاد انسان حاصل از IVF با همکاری Patrick Steptoe و Robert Edwards در 25 جولای 1978 به دنیا آمد (Steptoe and Edwards, 1978).
به طور کلی، طی فرایند IVF، تخمک بالغ با اسپرم ظرفیتپذیر شده، تحت شرایط خاص آزمایشگاهی از جمله میزان کنترل شده O2، CO2، رطوبت و دما لقاح داده میشوند. یک لقاح موفقیتآمیز، تا حدودی وابسته به ترکیبات محیط مورد استفاده در این فرایند است. اساس محیطهای پرکاربرد در این زمینه، محیطی به نام مایع لولهی رحمی انسان52 است که در سال 1985 به عنوان اولین محیط تخصصی لقاح آزمایشگاهی توسط Quinn فرمولبندی شد (جدول ‏11) (Quinn et al., 1985).

جدول ‏11: ترکیبات محیط HTF ساخته شده توسط Quinn (Quinn et al., 1985).
mM
Component
101.6
NaCl
4.69
KCl
0.20
MgSO4 . 7H2O
0.37
KH2PO4
2.04
CaCl2 . 2H2O
25
NaHCO3
2.78
Glucose
0.33
Na pyruvate
21.4
Na lactate
100 U/ml
Penicillin
50 µg/ml
Streptomycin SO4
0.001% (w/v)
Phenol red

1-2-1-1 کیفیت سلول تخم
یکی از چالشهایی که در لقاح آزمایشگاهی وجود دارد، کاهش دادن تعداد رویانهای انتقالی، بدون پایین آمدن شانس باروری است. اولین قدم در این مسیر، انتخاب سلولهای تخم سالم و مناسب است. کیفیت سلول تخم را میتوان از طریق بررسی تعداد، سایز و موقعیت پیش هستهها در آن، اجسام قطبی و کیفیت سیتوپلاسم ارزیابی کرد. یک تخمک لقاح یافتهی نرمال، دارای دو پیش هسته و دو جسم قطبی میباشد. اما پیش هستهها همواره به راحتی قابل مشاهده نیستند. در ا
ی
ن صورت با مشاهدهی دو جسم قطبی، آن را سلول تخم در نظر میگیریم. پیش هستههای نر و ماده بسیار به یکدیگر نزدیک و معمولا همسایز یا با اختلاف خیلی جزئی تفاوت سایز دارند. سیتوپلاسم با کیفیت نیز، بدون واکوئل و یکنواخت میباشد (Lundin et al., 2001, Balaban et al., 2004).

1-2-2 کشت آزمایشگاهی رویان53
کشت آزمایشگاهی سلولهای تخم حاصل از لقاح خارج رحمی، راهکاری دیگر در راستای افزایش نرخ باروری است. رشد سلول تخم، در محیط کشت و بررسی گذر آن از مراحل اولیهی تکوین، به انتخاب رویان مناسب، جهت انتقال به رحم کمک میکند.
در این رابطه، مرحلهی بلاستوسیست بسیار حائز اهمیت است زیرا رویان در این مرحله، دارای ژنوم فعال شده و پتانسیل تکوینی بالاتری نسبت به مراحل قبلی از خود نشان میدهد. بهعلاوه، با بررسی ویژگیهای مورفولوژیکی آن، میتوان موفقیت در لانهگزینی را تا حدودی پیشبینی و بنابراین رویان مناسبتری را جهت انتقال به رحم انتخاب کرد. به این شکل بدون کاهش نرخ باروری میتوان تعداد رویانهای انتقالی را کاهش داد (Wittemer et al., 2000, Kovačič and Vlaisavljević, 2012).
قابل ذکر است که ارزیابی مورفولوژیکی بلاستوسیستها، با بررسی نسبت حجم حفرهی بلاستوسل به کل رویان، حجم توده سلولی داخلی و انسجام سلولهای ترفواکتودرم انجام میپذیرد. در این راستا معیارهای دیگری مانند درجهی تکه تکه شدن54، ضخامت زونا، چند هستهای بودن بلاستومرها و نسبت تعداد سلولهای تودهی داخلی به کل سلولها نیز، مورد توجه قرار میگیرد (Kovačič and Vlaisavljević, 2012).
هرچند انعطاف پذیری بالای رویان پستانداران، در مواجه با شرایط برونتنی55 باعث زندهمانی آنها در محیطهای کشت شده است، اما هنوز نرخ زندهمانی و کیفیت رویانها در این حالت نسب به حالت درونتنی56 پایینتر میباشد. به همین دلیل تلاشهای بسیاری در جهت بهبود این محیطها صورت پذیرفته است. اولین محیط تخصصی کشت رویان (شامل 9 ترکیب) در سال 1956 توسط Whitten ساخته و رشد رویان 8 سلولی موش تا مرحلهی بلاستوسیست در این محیط گزارش شد. مطالعات بعدی توسط Biggers (Biggers et al., 1967) نشان داد که تکوین سلول تخم موش تا مرحلهی دو سلولی، وابسته به حضور پیروات در محیط کشت است (Summers and Biggers, 2003). از آنجایی که رویان تا مرحلهی 8 سلولی به جای گلوکز، از پیروات و لاکتات به عنوان منبع انرژی استفاده میکند و حضور گلوکز در محیطهای ساده موجب تاخیر یا توقف در تکوین میشود، محیط کشت CZB در سال 1989 توسط Chatot روی کار آمد. این محیط که حاوی EDTA57، میزان افزایش یافتهی پیروات، لاکتات و همچنین گلوتامین جایگزین گلوکز بود ، موجب گذر رویان برخی نژادهای موش، از توقف موجود در مرحلهی دو سلولی و رشد آنها تا مرحلهی بلاستوسیست شد (Chatot et al., 1989). در سال 1992 محیط کشت SOM58 توسط Lawitts و Biggers ساخته شد که بعدها پس از افزایش غلظت NaCl و KCl،KSOM59 نام گرفت (جدول ‏12).
این محیط، رشد سلول تخم تا مرحلهی بلاستوسیست را بهتر از محیطهای قبلی حمایت میکند و تا به امروز یکی از پرکاربردترین محیطها در زمینهی کشت رویان موش به حساب میآید (Lawitts and Biggers, 1993).
جدول ‏12: ترکیبات محیط KSOM ساخته شده توسط Lawitts و Biggers (Lawitts and Biggers, 1993).
Concentration
gr/liter
Component
5.55
NaCl
0.186
KCl
0.0476
KH2PO4
0.0493
MgSO4
1.87
Lactate
0.022
Pyruvate
0.036
Glucose
0.146
Glutamine
1
BSA
0.0038
EDTA
2.10
NaHCO3
0.251
CaCl2 . 2H2O

1-2-3 انجماد60
یکی از پیشرفتهای تکنیکهای کمک باروری در دهههای اخیر، انجماد است. این تکنیک در مواردی که تعداد رویانهای حاصل از لقاح آزمایشگاهی، بیش از تعداد مورد نیاز جهت انتقال به رحم باشد، مورد استفاده قرار میگیرد. در این حالت اگر دورهی درمانی با شکست مواجه شود، میتوان از رویانهای منجمد شده، در دورههای بعدی استفاده گردد و احتیاجی به تکرار کامل مراحل درمانی نمیباشد. انجماد همچنین برای حفظ تخمک خانمهایی که فعالیت تخمدان آنها به دلایل مختلف مانند بیماریهای لگنی و درمانهای کلینیکی همچون شیمی درمانی کاهش مییابد و یا تخمکهای آنها آسیب میبیند، مناسب میباشد (Porcu et al., 1997, Tucker et al., 1998).

1-2-3-1 اصول انجماد
سلولهای زنده، به منظور ذخیرهی طولانی مدت، باید به حالتی از حیات معلق61 درآیند که با گذشت مدت زمان نامعلوم، قابلیت بازگشت به حالت طبیعی و ادامهی حیات را داشته باشند. به این منظور، از دماهای پایین استفاده میشود. به طور کلی دمایی که برای ذخیرهی سلولهای پستانداران استفاده میشود، شC 196- (دمای نیتروژن مایع) است که به نظر میرسد برای این هدف کافی باشد. زیرا در این دما، آب تنها به حالت جامد وجود دارد و هیچ گونه واکنش بیولوژیک شناخته شدهای رخ نمیدهد (Mazur, 1980). از آنجایی که رویان پستانداران در دمای C37 زنده میماند و هیچ فعالیت بیولوژیکی در دمای مC 196- اتفاق نمیافتد، محدودهی خطرناک برای رویان در طول فرایند انجماد، طی انتقال دما میباشد. یعنی در طول سرد شدن تا دمای بC 196- و در طول فرایند گرم شدن62 دوباره تا دمای C 37. هنگامی که آب به زیر نقطهی انجماد سرد میشود، ساختار جامد کریستالی ایجاد میکند که به عنوان یخ شناخته میشود. از آنجا که تراکم یخ از آب مایع کمتر است، بنابراین حجم بیشتری نسبت به آب مایع اشغال میکند و منجر به ایجاد فشار و نیروهای شکننده روی اندامکهای درون سلولی میشود. بنابراین پیشگیری از تشکیل کریستال یخ، یکی از رموز اصلی در انجماد موفق است (Mazur, 1963). وقتی آب مایع به یخ تبدیل میشود، هر مادهی محلول در فاز مایع از قسمت جامد جدا میماند. این مواد، نقطه ان
جماد محلول باقی مانده و منجمد نشده را پایین میآورند. با ادامهی این فرایند، غلظت الکترولیتها و سایر مواد حل شده به سطوح بالایی میرسد که میتواند برای پروتئینهای داخل سلولی سمی باشد. بنابراین پیشگیری از اثر محلول63، دومین نکتهی کلیدی در انجماد موفق است (Lovelock, 1954). در طول فرایند گرم کردن، ذوب شدن یخ جامد و رها شدن آب آزاد، منجر به کاهش اسمولاریته محلول اطراف آن میشود. اگر فرایند گرم شدن، آهسته باشد، خطر اینکه آب آزاد دوباره به کریستال تبدیل شود زیاد است، که این امر آسیبهای بعدی را ایجاد میکند و در صورتی که این فرایند سریع انجام شود، فشار اسمزی ایجاد شده ممکن است منجر به انتقال ناگهانی آب از طریق غشا به داخل سلول و در نتیجه تورم و آسیب به سلول گردد (Mazur, 1980). این پدیده، شوک اسمزی نام دارد و پیشگیری از آن، سومین رمز انجماد موفق است. بنابراین فقط فرو بردن سلول یا رویان، درون نیتروژن مایع، منجر به موفقیت در انجماد نمیشود و سه اصل ذکر شده در بالا باید رعایت گردد. به همین جهت، در تمامی روشهای انجماد، از مواد شیمیایی خاصی به نام عوامل سرما محافظ64 استفاده میشود (Meryman, 2007).
1-2-3-2 مواد سرما محافظ
مواد سرما محافظ، ترکیبات شیمیایی محلول در آب هستند که در انجماد، به عنوان ضدیخ مورد استفاده قرار میگیرند و موجب افزایش نرخ زندهمانی سلولها طی این فرایند میشوند. این مواد را میتوان در دو گروه نفوذپذیر65 یا داخل سلولی66 و نفوذناپذیر67 یا خارج سلولی68 دستهبندی کرد (Jain and Paulson, 2006).
مواد سرما محافظ نفوذناپذیر، که اولین بار توسط Kasai و همکارانش (Kasai et al., 1981) مورد استفاده قرار گرفنتد، اغلب ملکولهای قندی بزرگی هستند که قابلیت ورود به سلول را ندارند. در طی فرایند انجماد، این مواد با ایجاد شیب اسمزی، آب داخل سلول را به بیرون میکشند و موجب چروکیدگی سلول میگردند. هرچند کاهش آب داخل سلول، موجب کاهش تشکیل کریستالهای یخ میشود، اما باید توجه کرد که خروج آب سلول به مقدار زیاد، باعث افزایش غلظت ترکیبات داخل سلولی و ایجاد اثر محلول میشود که این حالت برای سلول کشنده است. برای تعدیل این اثر، میتوان در محیطهای انجمادی از عوامل سرما محافظ نفوذپذیر استفاده نمود. ضدیخهای نفوذپذیر، ملکولهای کوچکی هستند که به آسانی و به سرعت از غشای سلول عبور میکنند. بنابراین با ورود به سلول، موجب حفظ اسمولاریتی داخل سلولی و بازگشت مقداری از آب خارج شده به سلول میشوند (Fasano, 2013). علاوهبراین، با قرارگیری بین ملکولهای آب و افزایش گرانروی69، حرکت ملکولهای آب را کاهش میدهند و در نقطهی انجماد، به دلیل اتصالی که با این ملکولها ایجاد کردند، مانع تشکیل کریستال یخ میشوند (Nash, 1962).
در فرایند ذوب، ضدیخهای نفوذ ناپذیر نق

No Comments

Leave a Reply