منبع پایان نامه ارشد درمورد هانسونلا، نوترکيب، وکتور

……………………………………………………………..41
انتقال پلاسميد نوترکيب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلي مورفا…………………………………41
هضم آنزيمي وکتور بياني pHan-gcsf-zeocin………………………………………………………………………41
الکتروپوريشن سلول هاي هانسونلا پلي مورفا………………………………………………………………………..42
تأييد کلونهاي نوترکيب هانسونلا با روش Colony PCR اختصاصي ژن زئوسين………………………..43
بيان پروتئينGCSF در هانسونلا پلي مورفا…………………………………………………………………………..44
کشت سلولهاي مخمري……………………………………………………………………………………………………..44
بررسي بيان پروتئين نوترکيب با روش SDS-PAGE………………………………………………………………44
تزريق نمونه پروتئيني به خرگوش………………………………………………………………………………………..45
ايمونوبلاتينگ…………………………………………………………………………………………………………………..46
فصل سوم نتايج
سنتز ژن gcsf…………………………………………………………………………………………………………………..49
PCR اختصاصي بر روي ژن gcsf………………………………………………………………………………………49
طراحي پرايمر هاي اختصاصي ژن gcsf……………………………………………………………………………….49
بهينه سازي واکنش PCR براي ژن gcsf……………………………………………………………………………….50
کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بياني هانسونلا………………………………………………………………………51
هضم آنزيمي وکتور کلونينگ pGH-gcsf و وکتور بياني pHan……………………………………………….51
بررسي کلونهاي نوترکيب pHan-gcsf…………………………………………………………………………………52
بررسي کلونها به روش سريع……………………………………………………………………………………………..52
انجام PCR ژن gcsf بر روي پلاسميد نوترکيب pHan-gcsf……………………………………………………52
هضم آنزيمي وکتور تأييد شده pHan-gcsf…………………………………………………………………………..53
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسين در وکتور بياني pHan-gcsf……………………………………………..54
PCR اختصاصي بر روي ژن مقاومت به زئوسين (Sh ble)…………………………………………………….54
کلون نمودن ژن zeocin در وکتور کلونينگ pGEM-T Easy………………………………………………….55
تأييد کلون هاي نوترکيب pGEM-zeocin……………………………………………………………………………55
بررسي سريع کلونهاي نوترکيب…………………………………………………………………………………………..55
هضم آنزيمي پلاسميد نوترکيب pGEM-zeo با BglII……………………………………………………………56
کلون نمودن ژن مقاومت به زئوسين در وکتور بياني pHan-gcsf………………………………………………57
بررسي کلونهاي نوترکيب pHan-gcsf-zeocin……………………………………………………………………57
بررسي سريع کلونهاي نوترکيب…………………………………………………………………………………………..57
بررسي کلونها به روش Colony-PCR…………………………………………………………………………………58
برش آنزيمي وکتور نوترکيب pHan-gcsf-zeo………………………………………………………………………58
انتقال پلاسميد نوترکيب pHan-gcsf-zeocin به سلول هانسونلا پلي مورفا…………………………………59
هضم آنزيمي وکتور بياني pHan-gcsf-zeocin و انتقال به سلول هانسونلا………………………………….59
تأييد کلونهاي نوترکيب هانسونلا با روش Colony-PCR ژن زئوسين……………………………………….59
بيان پروتئينGCSF در هانسونلا پلي مورفا………………………………………………………………………….60
تأييد پروتئين نوترکيب توليد شده با روش Immuno-Blotting……………………………………………….61
فصل چهارم :بحث و پيشنهادات
رويکرد کلي پژوهش…………………………………………………………………………………………………………63
فصل پنجم : منابع و پيوست
فهرست منابع و مواخذ……………………………………………………………………………………………………….66
پيوست‌ها…………………………………………………………………………………………………………………………75
مقدمه
توليد پروتئين هاي نوترکيب يک بازار ميليارد دلاري دارا مي باشد. از طرف ديگر توليد يک محصول نوترکيب جديد با انتخاب يک ميزبان مناسب شروع مي شود. در ميان سيستم هاي بياني مختلف، سلولهاي مخمري به عنوان تک سلولي هاي توليد کننده با ويژگي دستکاري هاي ژنتيکي ساده و داشتن مسيرهاي ترشحي اختصاصي که در توليد پروتئين کامل و فعال و انتقال آن به خارج از سلول مؤثر مي باشند، يکي از بهترين انواع سيستم هاي شناخته شده مي باشند. ساکاروميسس سرويزيه، پيکيا پاستوريس و هانسونلا پلي مورفا در اکثر مطالعات به عنوان سلولهاي مخمري ميزباني مورد استفاده قرار گرفته اند که داراي مسير مشترک بيوشيميايي در متابوليسم متانول مي باشند. در حال حاضر تکنولوژي هانسونلا به دليل ميزان بيان بالا مورد توجه جهاني قرار گرفته است. از جمله اقلام دارويي توليد شده در اين سلولها ميتوان به واکسن هپاتيت B، انسولين و اينترفرون آلفا و بتا اشاره نمود.
هدف از اين مطالعه ، استفاده از وکتور بياني طراحي شده جهت بيان فاکتور رشد کلني گرانولوسيتي (GCSF) نوترکيب به عنوان پروتئين کانديد مي باشد.
مواد و روش ها
cDNA کد کننده ژن فاکتور محرک رشد کلوني گرانولوسيتي در وکتور بياني طراحي شده مربوط به هانسونلا پلي مورفا که شامل پروموتر، توالي سيگنال پپتيد، توالي خاتمه دهنده رونويسي و شاخص انتخابي اوکسوتروفي مي باشد کلون گرديد و بدين ترتيب وکتور بياني مورد نظر ساخته شد. هضم هاي آنزيمي به منظور تأييد قطعات کلون شده در وکتور بياني طراحي شده انجام شد. القاء بيان پروتئين نوترکيب در اين سيستم با متانول صورت گرفت و ايمونوبلاتينگ جهت تأييد پروتئين توليد شده نوترکيب صورت گرفت.
نتايج
ماهيت تواليهاي کلون شده در وکتور بياني از طريق هضم هاي آنزيمي با استفاده از سايتهاي طراحي شده در توالي سنتز شده و مشاهده قطعات مورد نظر در ژل آگارز ارزيابي شد. وکتور نوترکيب به فرم خطي با روش الکتروپوريشن به سلول مستعد هانسونلا پلي مورفا انتقال داده شد و القاء بيان پروتئين با متانول صورت پذيرفت. پروتئيني حدوداً 20 کيلو دالتوني بر روي ژل SDS-PAGE مشاهده گرديد که با ايمونوبلاتينگ پروتئين توليد شده به عنوان GCSF تأييد شد.
بحث
پروتئين توليد شده با روش بلاتينگ تأييد گرديد. در ادامه بايستي عملکرد اين پروتئين در واکنشهاي ايمونولوژيکي مورد بررسي قرار گيرد. از طرف ديگر عملکرد اين پروتئين در مقايسه با فرم توليد شده در E. coli مقايسه شود.
کليد واژه ها
هانسونلا پلي مورفا، فاکتور محرک رشد کلوني گرانولوسيتي (GCSF)، مهندسي ژنتيک
فصل اول : مقدمه
در طول چند دهه اخير به سه دليل زير مطالعات زيادي بر روي مخمر هانسونلا پلي مورفا صورت گرفته است:
1. رشد سريع اين مخمر با مصرف متانول به عنوان تنها منبع کربن و انرژي،
2. تحمل دماهاي بالا (توانايي رشد در دماي °C49)،
3. تبادل آسان محتواي ژنتيکي بين سلولهاي هاپلوئيد و ديپلوئيد ( (Teunisson, 1960.
1-1ميکروبيولوژي هانسونلا
اين مخمر براي اولين بار در سال 1951 از آب پرتقال حاوي 50% قند در فلوريداي آمريکا جداسازي شد.
سلولهاي هانسونلا به هر دو صورت سلولهاي ديپلوئيدي و هاپلوئيدي رشد مي کنند. کلني ها بر روي محيط کشت جامد داراي طيف رنگي صورتي هستند که به علت آسکوسپورها مي باشد. کلني سلولهاي هاپلوئيدي و ديپلوئيدي از نظر رنگ، اندازه، چيدمان سلولي و ساير ويژگيها با يکديگر متفاوت مي باشند.
تاکنون اطلاعاتي در مورد توانايي هانسونلا پلي مورفا در تشکيل ميسليوم کاذب پيدا نشده است (Teunisson, 1960; Wickerham, 1970).
شکل 1-1 مخمر H. polymorpha
هانسونلا پلي مورفا ميتواند در دماي بالا و در °C42 رشد کند. به نظر مي رسد در اين مخمر سنتز تره هالوز قسمتي از پاسخ به قحطي منبع کربن و شوک حرارتي است و پيشنهاد شده که اين ترکيب، فاکتور مهمي در مقاومت دمايي است (Reinders, 1999).
مطالعات انجام شده بر روي هانسونلا پلي مورفا به طور عمده به بررسي پروتئين هاي سلولي، ساختار سلولهاي مخمر در حال رشد و يا بررسي متابوليسم مخمر پرداخته اند.
در سويه هايي از اين مخمر که از متانول به عنوان منبع انرژي استفاده مي کنند، آنزيمهاي متانول اکسيداز و کاتالاز، به فرم کريستالي درون اندامکي به نام پراکسي زوم قرار گرفته اند (Van Dijken, 1975).
هانسونلا پلي مورفا بعنوان يک ارگانيسم متيلوتروف، يک مدل مطلوب براي تحقيق در مورد عملکرد پراکسي زم ها و تکامل حيات مي باشد. همچنين به منظور بررسي ژنتيکي جنبه هاي مختلف متابوليسم سلولي از جمله متابوليسم متانول، جذب نيترات و مقاومت به فلزات سنگين مورد مطالعه قرار مي گيرد ( (Mannazzu, 2000.
با وجود اين ويژگيها، هنوز قابليت هاي ژنتيکي و طبيعي سويه هاي مورد استفاده از اين مخمر کاملاً مشخص نيست و کنترل ژنتيکي فرايندهاي سلولي پايه از جمله کنترل تقسيم سلولي، توليد مثل و اسپورزايي هنوز با سؤالات زيادي مواجه مي باشد.
با اينحال هانسونلا پلي مورفا به عنوان يک ميزبان براي توليد پروتئين هاي خارجي(ترشحي به خارج از سلول) توجه زيادي را به خود جلب کرده است ( (Gellissen, 2000.
1-2مطالعات ژنتيکي
تحقيقات ژنتيکي تاکنون تنها بر روي سه سويه از اين مخمر انجام شده است که شامل سويه هاي DL-1، CBS 4732 و NCYC 495 مي باشند.
پيدايش سويه هاي هانسونلا پلي مورفا از سويه هاي جهش يافته اکسوتروف شروع شده است.اين موتانت ها از سويه هايي که در بالا نام برده شد با استفاده از ترکيب شيميايي N-متيل-N-نيترونيتروزو گوانيدين1 يا اتيل متان سولفونات به دنبال يک مرحله غني سازي با نيستاتين به دست آمده اند.
از طرف ديگر اشعه ماوراء بنفش نيز يک موتاژن بسيار قوي است که طيف

Author: y7oozita

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *